PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA

1. PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA Nukleotydy i kwasy nukleinowe

2. 4 N 5 3 2 6 1 N PIRYMIDYNA cytozyna tymina uracyl zasada O reszta kwasu ortofosforowego 5’ N O- P CH2 PURYNA adenina guanina O- O N 6 N 7 5 1 8 2 9 4 4’ 3 1’ N N cukier 2’ 3’ HOCH2 OH O HOCH2 OH O H H 2-deoksyryboza ryboza H H H H H H OH OH H OH Nukleotydy

3. O O O O O O O- P P P CH2 CH2 CH2 5’ N N O- P CH2 O- O- O- monofoforan nukleozydu O- O 5’ CH2OH wiązanie estrowe 4’ 1’ wiązanie N-glikozydowe O 2’ 3’ nukleotyd 4’ 1’ 2’ 3’ difoforan nukleozydu O O O O- O- O P P P O- O- O- trifoforan nukleozydu nukleozyd Nukleotydy

4. 5’ O 4’ 1’ cukier zasada zasada 2’ 3’ N N 5’ O wiązanie fosfodiestrowe wiązanie fosfodiestrowe 4’ 1’ cukier zasada 2’ 3’ N O 5’ 4’ 1’ cukier 2’ 3’ fosforan fosforan fosforan Fragment łańcucha kwasu nukleinowego koniec 5’ łańcucha OH koniec 3’ łańcucha

5. Kwasy nukleinowe RNA DNA kwas deoksyrybonukleinowy kwas rybonukleinowy bierze udział w rozkodowywaniu informacji zawartej w DNA koduje informację o budowie i działaniu całego organizmu

6. O O O- O P P CH2 CH2 monofoforan nukleozydu O- O- O O O- O P P O- O- trifoforan nukleozydu DNA dATP, dGTP, dCTP, dTTP RNA ATP, GTP, CTP, UTP

7. G C komplementarne parowanie zasad A T Podwójna helisa DNA

8. 5’ CTTATG 3’ 3’ GAATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAAAG 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTC 5’ 5’ GGTAC 3’ 3’ C 5’ 5’CAATTCAAAGCTTATG 3’ 3’ CATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAA 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 5’AGCTTATG 3’ 3’ATAC 5’ Enzymy restrykcyjne 5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’ Alu I AGCT TCGA Hind III AAGCTT TTCGAA Kpn I GGTACC CCATGG

9. 5’ GGTACCAATTCAA 3’ ||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 5’ GGTACCAATTCAA 3’ ||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’ 5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’ Hind III AAGCTT TTCGAA Hind III AGCTTATG 3’ | ATAC 5’ AGCTTATG 3’ | ATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA ligaza AGCTTATG 3’ | ATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA

10. Klonowanie DNA DNA zawierający wstawkę, którą chcemy przeklonować trawienie enzymem restrykcyjnym wektor wstawka trawienie enzymem restrykcyjnym ligacja wektora ze wstawką plazmid ze wstawką gotowy do wprowadzenia do bakterii

11. Hybrydyzacja jednoniciowa wyznakowana sonda komplementarna do cząsteczki A mieszanina jednoniciowych cząsteczek DNA hybrydyzacja w warunkach łagodnych hybrydyzacja w warunkach ostrych cząsteczki A, C i E tworzą stabilne dwuniciowe cząsteczki tylko cząsteczka A tworzy stabilną dwuniciową cząsteczkę

12. Hybrydyzacja denaturacja DNA w celu uzyskania jednoniciowych cząsteczek inkubacja błony z jednoniciową wyznakowaną radioaktywnie sondą DNA

13. dwuniciowy DNA denaturacja GCATATGTCAGTCCAG 5’ 3’ 3’ 5’ jednoniciowy DNA (matryca do sekwencjonowania) GCAT GCATATGTCAGTCCAG 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ CGTATACAGTCAGGTC CGTATACAGTCAGGTC CGTATACAGTCAGGTC 5’ GCAT 3’ 5’ przyłączenie znakowanego startera Sekwencjonowanie DNA

14. + dATP, dTTP, dCTP, dGTP ddATP ddTTP ddGTP ddCTP polimeraza DNA polimeraza DNA polimeraza DNA polimeraza DNA GCAT ATGTC GCAT A GCAT ATG GCAT AT GCAT 3’ 5’ 3’ GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCA GCAT ATGTCAG GCAT ATGT CGTATACAGTCAGGTC 5’ GCAT ATGTCAGTCC GCAT ATGTCAGTCCA GCAT ATGTCAGTCCG GCAT ATGTCAGT elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Sekwencjonowanie DNA

15. ddATP ddTTP ddCTP ddGTP 3’ G A C C T G A C T G T A 5’ Sekwencjonowanie DNA A T C G

16. sekwencja docelowa dwuniciowa matryca DNA bufor polimeraza Taq starter1 dNTP starter2 Reakcja PCR mieszanina reakcyjna

17. Cykl syntezy DNA w reakcji PCR etap 1 - denaturacja matrycy etap 2 - przyłączenie starterów etap 3 - wydłużanie starterów

18. CYKL 1 denaturacja 94C jednoniciowa matryca DNA

19. starter 1 starter 2 CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy 40-65C

20. CYKL 1 wydłużanie startera 72C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej starter 1 starter 2

21. CYKL 2 denaturacja matrycy 94C matryca DNA, który powstał w cyklu 1

22. CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy 40-65C

23. CYKL 2 wydłużanie starterów 72C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej powstają cząsteczki o długości sekwencji docelowej

24. Profil termiczny reakcji PCR cykl podstawowy cykle dodatkowe

25. 0,35 kb B2 B1 0,6 kb A2 A1 Część praktyczna mieszanina A: startery A1 i A2 mieszanina B: startery B1 i B2 plazmid pUC18/cDNAPPRas2 ze wstawką 0,8 kp

26. A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 - wzorce wielkości 2, 3, 4 - produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii) 5 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu 6 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji A, do której nie dodano żadnej matrycy 7 - produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii) 8 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu 9 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji B, do której nie dodano żadnej matrycy 10 - wzorce wielkości 1,35 kb 1,08 kb 0,87 kb 0,6 kb 0,6 kb 0,35 kb 0,31kb 0,28 kb 0,23 kb 0,19 kb