Download
metody detekce nukleotidov ch polymorfism n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Metody detekce nukleotidových polymorfismů PowerPoint Presentation
Download Presentation
Metody detekce nukleotidových polymorfismů

Metody detekce nukleotidových polymorfismů

150 Vues Download Presentation
Télécharger la présentation

Metody detekce nukleotidových polymorfismů

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Metody detekce nukleotidových polymorfismů MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

  2. Typ polymorfismu • SNP • Short repeats • Insertion/deletion

  3. Metody detekce nukleotidových polymorfismů • Hledání přítomnosti neznámé alely • Detekce známých alel

  4. Využívané metodiky • PCR • RFLP • ELFO na agaróze • Real time PCR • PAGE • SSCP, heteroduplexní analýza • Kapilární elektroforéza • v podstatě varianta PAGE

  5. Strategie volby metody • Flexibilita • Cena • Dostupnost • rychlost

  6. PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena

  7. Amplifikace DNA

  8. Základní komponenty reakce • voda • pufr • dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) • MgCl2 • Taq polymeráza • primers • templát

  9. Teplotní režim • 96ºC Iniciální denaturace • 96ºC denaturace • 40-72ºC annealing • 72ºC elongace • 72ºC závěrečná elongace • 4ºC zchlazení 30x

  10. Elektroforéza v agarovém gelu

  11. + -

  12. Přímá sekvenace • Viz praktikum  • Umožní detekovat dosud nepoznané mutace/polymorfismy • Drahá • Relativně zdlouhavá • Metody využívající sekvenační instrumentárium

  13. PCR s následnou RFLP • Pokud polymorfismus způsobuje vznik restrikčního místa, podrobíme produkt PCR působení daného enzymu a na agarové elektroforéze pozorujeme výsledek. • Mismatch primery – umožňují vnést restrikční místo do blízkosti SNP a umožní jeho detekci pomocí endonukleáz

  14. PCR s následnou analýzou délky produktů • Pokud je polymorfismus způsoben insercí/delecí většího počtu bází, produkt PCR analyzujeme přímo na agarové elektroforéze. V případě analýzy počtu dinukleotidových repetic používáme kapilární elektroforézu. • Alelově specifické primery – poskytnou produkt jen za přítomnosti dané aley

  15. Real-time PCR • Různé systémy sond (TaqMan, FRET) • Melting curve analysis

  16. Metody využívající kapilární sekvenátor • SNPlex • SNaPshot