Endonucleasas de Restricción

1. Endonucleasas de Restricción Enzimas que tienen la capacidad de cortar DNA doble cadena en una secuencia específica o restringida Extraídas y clonadas de bacterias: Nombre de ER: según la bacteria a partir de la cual fue aislada Ejemplo: EcoRI Eco: Género y especie: Escherichia coli R: Cepa RY12 I: primer ER aislada de este organismo • Forman parte de un sistema de Restricción-Modificación, actuando como un sistema de defensa contra patógeno, protegiéndolas del ataque de DNA foráneo (ej.: bacteriófago). • R: endonucleasa (corta DNA doble cadena rompiendo uniones fosfodiéster) • M: modifica al DNA por metilación (metilasa) • Es decir, cada enzima de restricción tiene una metilasa asociada. • Ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases. La metilasa metila una base determinada siempre dentro de la secuencia de reconocimiento, mientras que la endonucleasa puede cortar dentro de la secuencia de reconocimiento o fuera de ella, dependiendo del tipo de enzima. • La metilación en las dos hebras del DNA evita que la Enzima de Restricción pueda cortar la molécula de DNA. Este mecanismo es empleado por las bacterias para proteger a su propio DNA genómico y plasmídico del ataque de sus propias Enzimas.

2. Ejemplo: (específico para las de Tipo II) 1) Ambas cadenas metiladas no hay ni metilación ni restricción CH3 CH3 CH3 M.EcoRI 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ R.EcoRI CH3 CH3 CH3 2) Sólo una cadena metilada hay metilación y no restricción M.EcoRI 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ R.EcoRI CH3 3) Ninguna cadena metilada no hay metilación, sí restricción M.EcoRI 5´---- G AATTC ---- 3´ 3´---- CTTAA G ---- 5´ 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ R.EcoRI • El sistema R-M funciona como un sistema “inmune” • Mecanismo para resistir el ataque viral • Permite a la bacteria distinguir entre DNA propio y DNA foráneo: • las ER digieren al DNA foráneo no metilado • y protegen DNA propio por metilación

3. ¿Por qué el sistema R-M funciona como un “sistema inmune”? CH3 DNA del fago con las secuencias de reconocimiento de ambas ER 5´---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3´ 3´---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5´ 5´---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3´ 3´---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5´ Caso 1 CH3 CH3 EcoRI HindIII Lisis Bacteria EcoRI+HindIII- Caso 2 No hay lisis No hay lisis Bacteria EcoRI-HindIII+ CH3 DNA del fago con las secuencias de reconocimiento de ambas ER Caso 3 EcoRI HindIII Bacteria EcoRI+HindIII-

4. DNA metilasas o metiltransferasas: • Transferencia de un grupo metilo desde una molécula donante (SAM) a una A y C: • No requieren Mg2+ como cofactor • Eucariotas: asociadas a la inactivación génica: metilaciones en la posición C5 de las C en islas CpG • Procariotas: participan principalmente del sistema R-M • En las cepas de E.coli de laboratorio existen 3 DNA-MT: • Sistema hsd: AAC(N6)GTGC and GCAC(N6)GTT • Dam metilasa: GATC • Dcm metilasa: CCAGG y CCTGG • DNA plasmídico aislado de cepas E.coli Dam+ son resistentes al corte por MboI (GATC) • Si se quiere clivar una molécula recombinanate con ER sensibles a la metilación por estas MT, la misma debe ser amplificada y aislada a partir de cepas Dam- y Dcm-

5. Sistema de Restricción metilasa dependiente • Endonucleasas que clivan DNA doble cadena cuando está doblemente metilado o hemimetilado • En E.coli existen tres sistemas: • MrcA: m5CG • MrcBC: Pum5CG • Mrr: m6A Clasificación de ER • Composición de las subunidades • Especificidad de la secuencia de reconocimiento • Sitio de clivaje • Requerimiento de cofactores

6. Clasificación de ER

7. Tipo II(las que se emplean en el laboratorio) Las secuencias de reconocimiento pueden ser: sec palindrómicas y continuas (reconocidas por homodímeros) Ejemplo: EcoRI Secuencias simétricas y discontinuas (reconocidas por homodímeros) Ejemplo: BglI sec asimétricas y continuas (reconocidas por heterodímeros) Ejemplo: BbvCI Código de una letra N = A or C or G or T

8. SmaI 5´----CCCGGG ---- 3´ 3´----GGGCCC ---- 5´ 5´----CCC GGG ---- 3´ 3´----GGG CCC ---- 5´ EcoRI PstI 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ 5´---- CTGCAG ---- 3´ 3´---- GACGTC ---- 5´ 5´---- G AATTC ---- 3´ 3´---- CTTAA G ---- 5´ 5´----CTGCA G ---- 3´ 3´----G ACGTC ---- 5´ • Extremos: • Romos: • Cohesivos: • 5’ protruyente • 3’ protruyente • La ligación de extremos cohesivos requiere complementariedad de secuencia • La ligación de extremos romos no requiere de secuencias complementarias: dos extremos romos cualquiera pueden ser unidos por la DNA ligasa. • La eficiencia de ligación de extremos cohesivos es mayor que la de extremos romos.

9. Isoesquizómeros: • Son distintas ER que reconocen la misma secuencia, generalmente con distintas especificidades. Pueden generar: • los mismos extremos: Acc65I y KpnI • distintos extremos: • ER que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos extremos: 5´----G GTACC ---- 3´ 3´----CCATG G ---- 5´ 5´----GGTACC ---- 3´ 3´----CCATGG ---- 5´ SmaI BamHI 5´----CCCGGG ---- 3´ 3´----GGGCCC ---- 5´ 5´----GGATCC ---- 3´ 3´----CCTAGG ---- 5´ 5´----CCC GGG ---- 3´ 3´----GGG CCC ---- 5´ 5´----G GATCC ---- 3´ 3´----CCTAG G ---- 5´ XmaI BglII 5´----CCCGGG ---- 3´ 3´----GGGCCC ---- 5´ 5´----AGATCT ---- 3´ 3´----TCTAGA ---- 5´ 5´----C CCGGG ---- 3´ 3´----GGGCC C ---- 5´ 5´----A GATCT ---- 3´ 3´----TCTAG A ---- 5´

10. EcoRI 5´---- GAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAAG ---- 5´ 5´---- G AATTC ---- 3´ 3´---- CTTAA G ---- 5´ fill in(con DNApol + dNTPs) ligasa 5´---- GAATTAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAATTAAG ---- 5´ 5´---- GAATTAATTC ---- 3´ 3´---- CTTAATTAAG ---- 5´ XmnI(GAANN/NNTTC) PstI 5´---- CTGCAG ---- 3´ 3´---- GACGTC ---- 5´ 5´----CTGCA G ---- 3´ 3´----G ACGTC ---- 5´ 3´-5´exonucleasa 5´----C G ---- 3´ 3´----G C ---- 5´ Ligados entre sí o a otros fragmentos con extremos romos Cómo generar nuevas secuencias de corte 1- Corte, filling in/trimming back, religación: Filling in (5’ protruyente) Trimming back (3’protruyente)

11. 2- Ligación de extremos complementarios: 5´----GGATCT---- 3´ 3´----CCTAGA ---- 5´ 5´----G GATCC ---- 3´ 3´----CCTAG G ---- 5´ BamHI Ligasa 5´----A GATCT ---- 3´ 3´----TCTAG A ---- 5´ 5´----AGATCC ---- 3´ 3´----TCTAGG ---- 5´ BglII MboI(/GATC) 3- Ligación de extremos romos: 5´----AGATC---- 3´ 3´----TCTAG---- 5´ 5´----AG CT---- 3´ 3´----TC GA---- 5´ AluI MboI(/GATC) Ligasa 5´----GAT ATC---- 3´ 3´----CTA TAG---- 5´ EcoRV 5´----GATCT---- 3´ 3´----CTAGA---- 5´

12. NcoI HindIII NcoI HindIII Digestión con ER Fragmento amplificado Yep51 + Ligación Digestión con HindIII p p Usos en el laboratorio • Generar fragmentos de DNA de tamaño definido para: • generar moléculas recombinantes: clonado • Screening de transformantes por ER Calle1: markers (23.13, 9.42, 6.55, 4.36, 2.32, 2.07 y 0.56 kpb) Calle2: vector digerido sin inserto Calle3: vector con inserto digerido (digestión completa)

13. DNA (≤1 μg) libre de contaminantes pH (Tris-Cl) sales (NaCl o KCl) =Fi cofactores (Mg2+) BSA Buffer de reacción (1X) (viene 10X) ER (1 μl= 10U) mantener en frío última en ser agregada glicerol < 5% v/v 1UE: cantidad de enzima que corta completamente 1 μg de DNA del fago lambda en un volumen de 50 μl en 1 hs usando el buffer correspondiente H2O csp 50μL En el laboratorio: reacción de digestión con ER • Elección de la ER • Extremos, secuencia y frecuencia de corte, y la cepa • 2) Reacción de digestión • 3) Mezcla: pipetear + spin-down • 4) T 37ºC (ó 50-65ºC) • 5) tiempo: 1 hs • (compromiso entre tiempo y cantidad de enzima) • Tiempos muy prolongados: cortes inespecíficos: “Actividad STAR” • 6) Frenar de la reacción: • calor o shock térmico (65-80ºC por 20’) • fenol/cloroformo y posterior precipitación del DNA

14. Actividad STAR: • Algunas enzimas (en condiciones de reacción que no son las óptimas) pueden producir cortes en secuencias que son similares a sus secuencias de corte. • Ejemplo: • EcoRI en condiciones óptimas cliva: • 5´ G/AATTC 3´ • en condiciones no óptimas puede clivar: • 5´ N/AATTN 3´ • Condiciones que contribuyen a la actividad STAR • 1- glicerol [>5% v/v] • 2- alta UE/ µg of DNA (>100 UE/µg) • 3- baja Fi [<25 mM] • 4- alto pH [>pH 8.0] • 5- sv orgánicos (DMSO, etanol) • 6- sustitución de Mg++ por otros cationes divalentes (Mn++, Cu++, Co++, Zn++) • 7- tiempo de incubación mayor al óptimo • 8- fragmento de DNA amplificado por PCR, sin previa purificación del mismo • Cómo inhibir la actividad STAR • 1- mín UE (digestión completa) • 2- DNA libre de contaminantes • 3- aumentar Fi 100-150 mM • 4- pH 7.0. • 5- Mg++

15. En los catálogos se describen las distintas características de cada enzima, como las siguientes:

16. Secuencia a digerir: Existen programas en internet en los cuales uno puede introducir la secuencia de bases completa simple cadena y obtener el MAPA DE RESTRICCIÓN. Ejemplo: Neb cutter V2.0 Secuencia del gen BCY1: Z No presenta las secuencias de corte para HindIII ni NcoI

17. NcoI NcoI Primers: Forward: 5' GACCATGGTATCTTCTTTGCCCAAGG 3' Reverse: 5' GGAAGCTTTTAATGTCTTGTAGGAT 3' HindIII Digestión doble • Digerir un mismo fragmento de DNA con dos ER distintas. Por ejemplo: hacer clonado direccional • evitar tener que precipitar al DNA dos veces, lo cual podría resultar en la pérdida de masa de DNA • ahorrar tiempo • A tener en cuenta: • En el vector: • Las secuencias de reconocimiento de las ER a emplear no deberán solaparse, y deberán estar a una determinada distancia en pb cuando se realiza una digestión doble. • En el fragmento: la distancia del sitio de corte al extremo del fragmento

18. Tabla de doble entrada: Digestión doble • Buffer de reacción compatible • Incompatibilidad digestión secuencial : • corrección del buffer o T • b) precipitación del DNA