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Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso

I SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO ESTADO DE SÃO PAULO 6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP. Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso. Vilma Regina Martins, PhD.

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Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso

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Presentation Transcript

  1. I SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO ESTADO DE SÃO PAULO 6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP. Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso Vilma Regina Martins, PhD Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer

  2. Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis Animais “Scrapie” ovelhas e carneiros Encefalolia Espongiforme Bovina (BSE) marta (MTE), cervo (CWD), felinos (FSE), antílopes (EUE) e primatas (ZPSE) Humanos Kuru Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) Insonia Familiar Fatal

  3. Encefalopatias Espongiformes transmissíveis (cérebros) CJD BSE Kuru Scrapie

  4. Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis Quem é o agente infeccioso? Quais são suas características físico-químicas? Como ocorre sua propagação?

  5. Caracterização do agente infeccioso Cérebro de animais infectados Purificação do agente infeccioso extrato Inoculação em um animal sadio menor inóculo tem maior atividade infecciosa Produção da mesma patologia vista no primeiro animal

  6. scrapie (%) atividade Dose de UV Susceptibilidade do agente infeccioso à UV gene bactéria bacteriófago

  7. Características químicas do agente infeccioso Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV) Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol) Agente infeccioso sem material genético (DNA ou RNA) composto apenas de proteína (PrPsc) Prions = proteinaceus infectious particle Stanley Prusiner, 1983

  8. Identificação do agente infeccioso agente infeccioso purificado Imunização de coelhos Produção de anticorpos contra o agente infeccioso Reação positiva em cérebro infectado Reação positiva em cérebro NÃO infectado ??? Cérebro sadio tem uma proteína semelhante à infecciosa Prion celular

  9. Como ocorre a geração de novo agente infeccioso na ausência de material genético? Proposta: A proteína infecciosa catalisa a formação de novas proteínas infeccionas a partir da homóloga normalmente produzida pela célula. Prova: Importância da proteína prion celular na doença.

  10. Proteína prion celular Gene codificador PRNP Cromossomo 20 humano Cromossomo 2 camundongo Deleção de PRNP em camundongos Animais “knockout” para PrPc

  11. 100 100 80 80 60 60 PrP +/+ Animais sem doença (%) CD-1 40 40 PrP 0/0 20 20 0 0 90 140 190 240 340 390 440 Incubation time (days) Tempo de incubação (dias) Camundongo PRNP “knockout” A presença da proteína celular é absolutamente necessária para o estabelecimento de infecção por prions! Büller et al., Cell 73, 1339-47, 1993

  12. Célula normal Célula infectada PrP gene PrP gene PrP mRNA PrP mRNA PrPc PrPsc PrPc Mecanismo de conversão PrPc- Prion Hipótese de “protein only” só proteína Adaptado de Weissmann, 1994

  13. Proteínas com diferenças conformacionais PrPc Prion Altamente insolúvel Deposição em placas Normal

  14. Prions “Proteinaceous infection particles” • Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV) • Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol) • Contém uma forma anormal de uma proteína celular, PrPc • Diferem de PrPc apenas estruturalmente • Presença de PrPc é absolutamente necessária para a infecção

  15. Doenças humanas por prions Infecciosas/Iatrogenicas Transplante de córnea (CJD) Inoculação acidental de tecido cerebral(CJD) Hormônio de Crescimento (cadáver) canibalismo (Kuru) vCJD injestão de carne contaminada com BSE Genéticas Mutações no gene de Prion celular GSS, FFI, CJD Esporádicas caso completamente desconhecido 1:2,000,000

  16. BSE X vCJD 2000 – 79 cases of vCJD (Hilton DA, J. Neuroph. Appl. Neurobiol 26 (5), 405-407)

  17. Evidências da transmissão do BSE para humanos Transmissão de BSE para macacos induziu a formação de placas “floridas” similares às presentes na nvCJD. Prion Biology and Diseases, Stanley Prusiner, 2ª edição, 2003

  18. Do intestino ao cérebro Translocação através do epitélio intestinal Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006

  19. Neuroinvasão a partir do intestino Vagus nerve Splanchnic nerve Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006

  20. Barreira entre espécies Barreira entre espécies Humanos nvCJD Scrapie ovelha Gado bovino EEB - BSE Transplantes Transfusão sangüínea Barreira entre espécies ? Humanos Cervos Chronic Wasting Disease CWD

  21. THE LANCET • Vol 363 • February 7, 2004 Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion C A Llewelyn, P E Hewitt, R S G Knight, K Amar, S Cousens, J Mackenzie, R G Will Findings 48 individuals were identified as having received a labile blood component from a total of 15 donors who later became vCJD cases and appeared on the surveillance unit’s register. One of these recipients was identified as developing symptoms of vCJD 6·5 years after receiving a transfusion of red cells donated by an individual 3·5 years before the donor developed symptoms of vCJD. Interpretation Our findings raise the possibility that this infection was transfusion transmitted. Infection in the recipient could have been due to past dietary exposure to the BSE agent. However, the age of the patient was well beyond that of most vCJD cases, and the chance of observing a case of vCJD in a recipient in the absence of transfusion transmitted infection is about 1 in 15 000 to 1 in 30 000.

  22. Doenças humanas por prions

  23. EXON I INTRON EXON II ORF mRNA ORF 5’ An O gene PRNP e a proteína prion celular Prnp

  24. Mutações na proteína PrPc associadas a doenças herdadas de padrão autossômico dominante 105 145 178 183 217 200 210 232 198 octa 102 117 171 180 4 ou 5 P P A y N D V T F E V Q M NH2 COOH < 3 ou > 8 L L V STOP S N I A S K I R R CJD Doença Psiquiátrica CJD ou FFI GSS Martins e cols, in Neuropsiquiatria Geriátrica, 2000

  25. FFI Curvas de mortalidade distribuídas por sexo e idade FFI Sporadic CJ GSS New variant CJD

  26. nvCJD X CJD esporádico nvCJD esporádico

  27. Presença de polimorfismos no gene PRNP Codon 129 polimorfismo M129M 37% M129V 52% V129V 11%

  28. Polimorfismo no codon 129 e susceptibilidade às doenças por prions

  29. Procedimentos de diagnóstico para doenças por prions Dosagem da proteína 13.3.3 Em LCR Avaliação de polimorfismos/mutações no gene PRNP Cérebro, orgãos linfóides e músculo esquelético

  30. Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP ) Sangue periférico Separação dos leucócitos Purificação do DNA DHPLC Cromatografia líquida de alta resolução Seqüênciamento direto

  31. Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP ) Coleta de 5 ml de sangue periférico com anti coagulante (K3 EDTA) -20ºC – maior tempo de armazenamento 4ºC – máximo 12 h Gelo reciclável Gelo seco Envio ao Centro de Referência

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