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Vectores

Vectores. Plásmidos o Vectores Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Vectores de clonado , son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias.

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Presentation Transcript

  1. Vectores Plásmidoso Vectores Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. Vectores de expresión, poseen toda la información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.

  2. PLASMIDOS de DNA que se encuentran en : moléculas y se replican en forma independiente del cromosoma Vectores de clonado bacterias Características: • Son pequeños (miles de pares de bases) • Son circulares • Tienen un único origen de replicación • Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción • Gran numero de copias • Marcadores que permitan su reconocimiento

  3. Sitios de restricción únicos Marcadores genéticos (permiten selección de transformantes) Orígen de replicación Características generales de un vectores de clonado: mcs pBR322 4361 bp Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)

  4. Elementos promotores Promotor TataBox Vectores de expresión eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador. Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa. Constitutivos: SV40, RSV, CMV, hEF-1a Inducibles: Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona

  5. Vectores de expresión eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador. Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa. Terminador: Sitio de terminación de la transcripción. Sitio de unión a ribosomas: se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción (Secuencias Kozak y codón ATG). Sitio de clonado múltiple (MCS):Región del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restricción. Factor de selección: Codifica el/los marcador/es de selección que permita diferenciar células transformadas. Otras características: secuencias codificantes para fusion-tag, His-tag, péptido señal de localización periplasmatica, etc. Segmentos de DNA para recombinación homóloga (para transfecciones estables).

  6. Vectores de expresión eucariotas

  7. k Obtención de grandes cantidades del plásmido para su posterior transfección a células eucariotas. Resumiendo.....

  8. PTP1B pGFP-N1 Clonado de PTP1B en el vector de expresión eucariota pGFP-N1

  9. Transfección de células eucariotas

  10. Se usa el término Transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a las células eucariotas mediante métodos químicos o físicos. • Se denomina Infección a la introducción de DNA foráneo dentro de las células eucariotas mediante la utilización de moleculas virales.

  11. Objetivos de la transfección - Expresión de proteínas para su purificacón. - Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular. - Estudio de promotores y elementos regulatorios. - Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. • Estudio de interacción de proteínas. • - Estudio de localizacion subcelular de proteínas. - Terapia génica.

  12. Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos. Métodos químicos: DEAE-Dextrano Coprecipitados de Fosfato de calcio Lípidos cationicos (Liposomas) Métodos físicos: Biobalística Microinyección Electroporación

  13. Métodos químicos

  14. Métodos Físicos Electroporación Microinyección Biobalistica

  15. Métodos Físicos Biobalistica

  16. Resumen Liposomas alta eficiencia, no-tóxico, estables Fosfato de calcio simple, baja eficiencia, no para estable DEAE-dextrano simple, alta efiencia, no para estable,toxico para algunas líneas celulares Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte Microinyección laborioso, alta eficiencia Biobalística baja eficiencia, muy costosa, se han logrado buenos resultdos solo para células vegetales

  17. Transfección estable y transiente • Por integración • Por recombinación homóloga • Requiere de un marcador de selección en el vector • Util para estudios que impliquen inducción de la expresión Transfección estable

  18. Transfección estable y transiente Transfección transiente (48 a 72 horas) • Análisis rápido • Múltiples propósitos • Análisis de secuencias regulatoria

  19. Consideraciones para transfección con lípidos cationicos Tansfección en presencia de suero Antibióticos en el medio de cultivo Densidad celular Elección del promotor Cantidad de DNA

  20. Infección: proceso mediado por una molécula viral donde la células target son infectadas con un virus que lleva clonado la secuencia de interés en su genoma. Ejemplos: Vaccinia Semmliky Baculovirus

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