TECHNIKY PCR

1. TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction-polymerázová řetězová reakce

2. Outline • Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymeráza • Princip procesu PCR • Optimalizace PCR • Typy PCR • Aplikace PCR a využití v praxi

3. Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP) http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html

4. “Koncept párování bazí je striktně konzervativní“ Cytosine Guanine From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html

5. HO T A G G OH Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end 3’ end • konce dsDNA nejsou stejné • jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární • DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena 5 4 1 2 3 C T A C 3’ end 5’ end

6. Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: • složení bazí • rozpouštědle • iontové síle • pH • délce DNA Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49

7. DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů • separace řetězců • syntéza krátkých RNA primerů • syntéza dvou nových DNA helixů • podílí se enzymy: DNA primáza helikáza DNA polymeráza DNA ligáza SSB-proteiny http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html

8. Vlastnosti DNA polymerázy 1. POLYMERÁZOVÁ AKTIVITA • Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec • Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3'-5' exonukleázová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukleázová aktivita - odštěpuje RNA primer

9. DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymeráza 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerázy - DNA polymerase I in vitro polymeráza vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH

10. Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Forward primer dNTPs 5’ 3’ DNA POL TTGAGAAAGGAATAAGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’

11. DNA POL Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Reverse primer dNTPs 3’ 5’ GCATATACTCGATTTCT 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’

12. PCR: Co to je? • Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA • Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) • The idea • Ghobind Khorana 1971 • Kary Mullis 1983 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce

13. Jak funguje PCR • Řetězová reakce vychází z DNA replikace • Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty • potřeba silného enzymu (polymerázy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách • Polymeráza izolovaná z termofilní bacterie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymeráza

14. PCR komponenty • Templátová DNA • vzorek k amplifikaci • Primery • krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace • dATP, dTTP, dCTP, dGTP • volné stavební jednotky DNA • Thermostabilní DNA polymeráza (e.g., Taq, Pfu) • Pufr a soli (KCl, MgCl2)

15. Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu Proces

16. Problémy: • PCR je velmi citlivá na kontaminace • Častý problém - nespecifická amplifikace • Polymeráza pracuje i při nízských teplotách (e.g., během nastavování reakce) • “Hot start” PCR je řešení • Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu • “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici: …gacgt, …gacga, …gacgg, …gacgc) • “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech • Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí

17. Navrhování primerů • Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé • Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA • 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze • Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 • Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm • Vyvarovat se repetitivním sekvencím • Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery

18. Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’

19. Praktické provedení PCR • PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko

20. Praktické provedení PCR • objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL • složení: • Templátová DNA 1-1000ng • Primery 10 -20 pmols • 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl • MgCl2 0.5 -3.0 mM • 50 ųM každého nukleotidudATP, dGTP, dTTP, dCTP • 2 jednotky Taq polymerázy

21. Praktické provedení PCR • Počáteční denaturace 94oC 3-5 min • denaturace 94oC 30 sec • annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze • počet cyklů 25-35 x

22. Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza

23. PCR Optimalizace Nespecifická amplifikace

24. Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) • vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT • jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer • hledání nových genů • tvorba cDNA knihoven • hledání mutací • zjišťování síly exprese různých genů

25. RACE PCR(rapid amplification of cDNA ends) • vychází z RT-PCR • používá se k hledání celé sekvence nového genu • nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu • vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

26. inverzní PCR • Amplifikace neznámých segmentů DNA

27. asymetrická PCR • sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond • amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA • SEKVENCOVÁNÍ DNA • automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR • jednozkumavková reakce • PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) • dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery • velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře • fluorometr s automatickým vyhodnocením

28. multiplex PCR • více amplifikací v jedné zkumavce • lékařská diagnostika nested PCR • 2 po sobě jdoucí PCR • zvyšování specificity PCR

29. long PCR • amplifikace dlouhých úseků, polymerázové kokteily – např. Klenowův fragment + Pfu polymeráza • Pwo polymeráza z Pyroccocus woesei

30. in situ RT PCR • lokalizace translace a exprese genů

31. real time PCR • slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu • využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) • fluorometr je součástí termocykleru

32. Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ • detekce virových a bakteriálních onemocnění

33. Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ • detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) • AS PCR alelicky specifická PCR primer navžen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmety DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji • Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

34. Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT

35. Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN • molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství • průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) • identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. EVOLUČNÍ BIOLOGIE ORNITOLOGIE