Vyšetřování parametrů humorální imunity

1. Vyšetřování parametrů humorální imunity

2. Imunochemické metody • řada metod založených na principu reakce: • antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK) • stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)

3. Vyšetřování humorální imunity • Imunoprecipitace v roztoku - Nefelometrie - Turbidimetrie • Imunoprecipitace v gelu - Imunodifuze - Elektroforéza • Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; IgM, IgG) • Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement) • Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA) • Imunobloting (southerblot, notherbloting,westernbloting) • imunofluorescence

4. Imunoprecipitační křivka

5. Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie Použití: • používá se prostanovení vzorků o vyšších koncentracíchproteinů • stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C3 a C4, C1 INH)

6. Nefelometrie Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab. Z – zdroj (laser, výbojka) K – kyveta se vzorkem D – detektor D ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D

7. intenzita odraženého světla koncentrace Ag Nefelometrie Vyhodnocení: dle kalibrační křivkysestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla

8. Turbidimetrie Princip:měří úbytek intenzity světla po jeho průchodu kyvetou obsahující IK Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce: Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D Vyhodnocení: dle kalibrační křivky

9. Radiální imunodifuze Postup: gel smícháme s Ab → inkubace s Ag → Ag difunduje do okolí a tvoří s Ab imunokomplexy (IK) →prstencový precipitát Hodnocení: změří se průměr prstence a koncentrace Ag se odečte na kalibrační křivce Použití principu RID: stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu, funkční test C1 INH

10. Jednoduchá radiální imunodifuze ( S1 – S7 – standardy, V1 – V2 – vzorky)

11. Dvojitá imunodifuzeOuchterlony • pasivní dvojitá imunodifuze - difunduje Ag i Ab • používá se pro stanovení extrahovatelných jaderných antigenů Identické antigeny neidentické antigeny částečně identické antigeny

12. Aglutinace (shlukování) • Antigen v této reakci má korpuskulární charakter (např. erytrocyt, bakterie, Ag navázaný na latexové častici…) • Protože protilátka (IgG, IgM) má více vazebných míst, dochází ke shlukování částic či buněk na jejichž povrchu je lokalizovaný Ag

13. EIA – enzyme immunoassay • skupina metod Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky(Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení) Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Ab, hormonů, cytokinů, TU markerů...)

14. EIA – enzyme immunoassay Dělení EIA metod: a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu: • ELISA (fotometrická detekce barevného produktu) • FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného produktu) • LEIA (luminometrická detekce světla uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu) b) dle postupu: • heterogenní x homogenní • kompetitivní x nekompetitivní

15. EIA – enzyme immunoassay ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay = heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevnatá (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je v konečné fázi vázán mezi dvěma vrstvami: Ab-Ag-Ab* nebo Ag-Ab-Ab* Princip: pevná fáze je pokryta př. Ag → přidáme vzorek s hledanou Ab → tvorba IK (Ag -Ab) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ → vzniká komplex Ag-Ab-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce → vznik barevného produktu

16. ELISA Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky

17. ELISA

18. ELISA

19. ELISA

20. EIA – enzyme immunoassay Pozn: FEIA – fluoroenzymoimunoanalýza - výsledkem reakce je fluoreskující produkt hodnocení: dle kalibrační křivky! - fluorometr měří intenzitu fluorescence použití: př. stanovení specifických IgE  LEIA – luminoenzymoimunoanalýza – výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu - způsobí uvolnění fotonů - světélkování hodnocení: dle kalibrační křivky! - luminometr měří intenzitu emitovaného světla použití: př. stanovování hladin specifických IgE, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.

21. RIA – radioimunoanalýza Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním isotopem (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK • vysoká citlivost a specifičnost • nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení, bezpečnost práce Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, ...

22. Nepřímá imunofluorescence Postup: 1. inkubace pacientova séra (Ab) se substrátem (Ag) fixovaným na podložním sklíčku 2. inkubace s anti-lidskou protilátkou značenou např. FITC (anti-human IgM/FITC, anti-human IgG/FITC, anti-human IgA/FITC) 3. detekce pomocí fluorescenčního mikroskopu

23. Nepřímá imunofluorescence