ENZIMAS

1. ENZIMAS • Un catalizador es una sustancia que sirve para bajar la energía de activación y aumentar la velocidad de la reacción • Los catalizadores de las reacciones biológicas son proteínas llamadas enzimas con alta especificidad • En una reacción catalizada por una enzima: E + S  E-S  E + P • La pequeña parte de la enzima a la que se une el sustrato se conoce como centro activo de la enzima Cómo realiza esta acción una enzima? Orienta los sustratos Agregan cargas a los sustratos Inducen la deformación en el sustrato Cambio de la forma de la enzima al unirse al sustrato

2. ENZIMAS NATURALEZA DE LAS ENZIMAS Hay razones para afirmar que las enzimas son proteínas: • Son inactivadas a altas temperaturas y su desnaturalización térmica da resultados similares a las proteínas • Son activadas en zonas restringidas de pH y presentan un punto óptimo donde su actividad es mayor • Los agentes que desnaturalizan proteínas destruyen o inactivan a las enzimas: calor, ácidos fuertes, metales que se combinan con ellas • Los problemas de solubilidad y precipitación son comunes a ambas, son solubles en agua o soluciones salinas, insolubles en alcohol, etc.

3. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS Se distinguen dos tipos de enzimas: Holoproteínas: están constituidas sólo por secuencias de aminoácidos poco frecuentes (ribonucleasa, lisozima) Heteroproteínas: su molécula está formada por dos o más componentes no proteicos llamados cofactores El cofactor puede ser un ión metálico (metaloproteínas) o una molécula orgánica llamada coenzima o bien, ambos El complejo enzima–cofactor se llama holoenzima, activo catalíticamente Cuando se separa el cofactor y queda la proteína inactiva catalíticamente se llama apoenzima El ión metálico puede actuar: 1) en el centro catalítico primario, 2) como grupo puente para reunir sustrato y enzima, 3) como agente estabilizante de la conformación de la proteína

4. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS La Tabla reúne algunas de las enzimas que contienen iones metálicos o los necesitan como cofactores

5. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS Coenzimas : contienen moléculas pequeñas orgánicas de alguna vitamina que en general son incorporadas por la dieta (trazas). Actúan como transportadores intermediarios de grupos funcionales, átomos específicos o electrones que son transferidos en la reacción enzimática global

6. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS Los aminoácidos se clasifican en: No esenciales:no participan en el proceso catalítico Estructurales:mantienen la estructura terciaria de la proteína enzimática e intervienen determinando la posición del centro activo de la molécula De unión o fijación:sujetan a la apoenzima al sustrato y orientan la molécula para aproximar la parte que va a ser atacada por la enzima al sitio catalítico Catalíticos:responsables directosde la actividad enzimática que forman el sitio catalítico Los aminoácidos de fijación y los catalíticos forman el centro activo de la enzima y ocupan una pequeña parte de la molécula de la enzima

7. REACCION ENZIMATICA

8. CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS

9. REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Está modulada por: Cambios de pH:hay un pH óptimo en el cual la conformación será la más adecuada Cambios de temperatura:hay una temperatura óptima donde la actividad enzimática es máxima Presencia de cofactores: Apoenzima + grupo prostético = holoenzima Presencia de inhibidores: competitivos por semejanza estructural y no competitivos que alteran la conformación espacial de la enzima impidiendo su unión al sustrato

10. REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Las cc de sustrato y de los productos finales: la velocidad de una reacción depende de la cc de sustrato y la presencia de productos finales que hacen que la reacción sea más lenta o invierten el sentido Modulación alostérica: hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones llamadas R (relajada) y T (tensa), R es la forma más activa porque se une al S con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos.Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región distinta del centro activo son los activadores alostéricos

11. REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimática son los moduladores negativos. Si estos moduladores actúan en lugares distintos del centro activo se llaman inhibidores alostéricos Modificación covalente: inactiva  activa (agregan Pi o AMP) y activa  inactiva (liberan algún grupo químico) En el catabolismo la forma más activa es la fosforilada y en el anabolismo la fosforilada es la menos activa Activación por proteólisis: se sintetizan como precursores y se activan liberando péptidos por hidrólisis (proenzimas o zimógenos)

12. ENZIMAS Progreso de una reacción: A  P donde los reactivos deben ser activados primero Los catalizadores como las enzimas rebajan la energía de activación requerida Al combinarse con los reactivos de modo transitorio se produce un estado de transición de menor energía de activación que el de la reacción no catalizada

13. ENZIMAS El poder catalítico es enorme, incrementan la velocidad de las reacciones químicas entre 10 8 y 10 20 veces En muchas reacciones la velocidad de rn se duplica por cada 10°C de aumento de temperatura Ejemplo: la catalasa que descompone el H2O2

14. CINETICA ENZIMATICA En condiciones óptimas de pH, temp, cofactores y cc saturantes de sustratos la velocidad de rn observada es la velocidad máxima (Vmax) que se puede medir ya sea por aparición de productos o desaparición de reactivos en función del tiempo A medida que la rn avanza la velocidad de acumulación de producto disminuye porque se consume el sustrato Para evitarlo se mide la velocidad inicial (v0) que es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero De esta forma la medida de v0 se realiza antes que se consuma el 10% del total de sustrato de modo que [S] se considera a constante

15. CINETICA ENZIMATICA Para estudiar la cinética se mide el efecto de la cc inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción manteniendo la enzima constante Cuando [S0] es pequeña la velocidad inicial es directamente proporcional a la [S] por tanto la reacción es deprimer orden A altas [S0] la enzima se encuentra saturada por el S y la velocidad ya no depende [S] en este punto la reacción es deorden cero y la velocidad es máxima (Vmax)

16. MODELO DE MICHAELIS MENTEN • Propusieron que las reacciones ocurren en dos etapas: primero se forma el complejo ES y luego el complejo da lugar a la formación del producto liberando la enzima libre k1 k3 E + S  ES  E + P k2 • En este esquema k1,k2 y k3 son las constantes cinéticas del proceso siendo: v1=k1[E][S], v2=k2[ES],v3=k3[ES] • La cc de enzima total (constante a lo largo de la reacción) [Et]=[E]+[ES] • Como [E]=[Et]-[ES], resulta que: v1=k1 [S] [Et] – k1[S][ES]

17. MODELO DE MICHAELIS MENTEN Este modelo adopta la hipótesis del estado estacionario, la [ES] es pequeña y constante y la velocidad formación (v1) del complejo ES es igual a la de su disociación (v2+v3) Como [ES] es constante la velocidad de formación de P es constante V=v3=k3[ES] Como v1=v2+v3 : k1 [S] [Et] – k1[S][ES]=k2[ES]+k3[ES] despejando [ES]: [ES] = [Et] [S] KM+[S] Siendo KM=(k2+k3)/k1 y se conoce como la constante de Michaelis Menten Si se introduce Vmax en la ecuación V= Vmax [S] KM + [S]

18. MODELO DE MICHAELIS MENTEN La representación gráfica es una hipérbola, la V max corresponde al valor máximo al que tiende la curva y la KM a la [S] a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es mas sencillo usar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S0] ya que es una línea recta donde: La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0=0)es -1/kM La ordenada al origen (1/[S0]=0 es 1/Vmax De esta forma a partir de datos experimentales se puede calcular los valores de KM y Vmax para una enzima para distintos sustratos

19. MODELO DE MICHAELIS MENTEN • La KM es importante por varias razones: • KM es la [S] para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima • El valor de KM da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: a < KM > afinidad de la enzima por el S y a > KM < afinidad por el S • La KM del sustrato natural es < que la de los sustratos análogos: si dos S de la misma enzima tiene distinta KM el que presente > KM tiene < afinidad por la enzima y la reacción trascurre a menor velocidad que con el S de menor KM, salvo cuando la v=vmax • Los valores de KMde muchas enzimas son próximas a las concentraciones fisiológicas de sus S, pequeñas variaciones en la [S] supone grandes cambios en la velocidad de la ruta metabólica

20. ESPECIFICIDAD Y MECANISMO DE ACCION Fisher enunció el principio que la molécula del S se adapta al centro activo de la enzima de mismo modo que una llave y una cerradura Hoy se sabe que la especificidad radica en la naturaleza de los aminoácidos de fijación del centro activo La especificidad del S se debe a dos rasgos estructurales: un enlace químico susceptible de ser atacado por la enzima una característica estructural llamada grupo determinante de la posición necesaria para efectuar su unión al centro activo

21. ACCION DE INHIBIDORES • Los inhibidores enzimáticos pueden impedir la entrada de un sustrato al centro activo u obstaculizar que la enzima catalice la reacción • La unión puede ser reversible (mediante uniones débiles no covalentes) o irreversible (unión covalente) • Los inhibidores reversibles se unen a la enzima, al complejo enzima-sustrato o bien a ambos • No experimentan reacciones químicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fácilmente por dilución o diálisis • Hay dos tipos de inhibición reversible y se clasifican en base al efecto producido por la variación de la concentración del sustrato de la enzima en el inhibidor en : competitivos, no competitivos • La inhibición reversible se puede describir cuantitativamente en base a sus efectos en las constantes cinéticas de la enzima

22. ACCION DE INHIBIDORES Inhibición competitiva: el inhibidor puede combinarse con la enzima libre compitiendo por el centro activo formando el complejo enzima-inhibidor (EI) La presencia de un inhibidor competitivo incrementa la KM aparente de la enzima por el sustrato, precisando cc superiores de S para alcanzar la V máx. E + I EI La constante del inhibidor: K1 = [E] [I] [EI]

23. ACCION DE INHIBIDORES Inhibición no competitiva: se combina con el enzima libre o bien con el complejo [ES] se unen a un centro distinto del activo de modo que no se forme el complejo ES a su velocidad normal o que no se descomponga a su velocidad habitual para liberar los productos de reacción Sus efectos no se anulan al aumentar la cc de S E + I EI ES + I ESI K1EI = [E] [I] [EI] K1ESI = [ES] [I] [ESI]

24. ACCION DE INHIBIDORES Inhibición irreversible: algunas enzimas experimentan inactivación irreversible cuando se tratan con agentes capaces de unirse covalentemente y modifican de modo permanente a un grupo funcional necesario para la catálisis Antagonismo metabólico: compuestos que presentan una estructura similar al S y la inhibición se llama metabolitos a las producidas o presentes en el metabolismo y antimetabolitos a sustancias que compiten parecidas a los metabolitos naturales (antibióticos) Inhibición alostérica: en las proteínas existen dos sitios, uno el centro activo y el otro es el sitio alostérico donde puede acomodarse de modo reversible un efector alostérico produciendo una alteración discreta de la estructura de la proteína

25. Inhibición por retroceso(feed back) o producto final A B … Z Enzima inhibida por Z • La enzima que cataliza el primer paso de un proceso biosintético es inhibida por el producto final del proceso • Activación por Precursor A B … Z En este caso el primer sustrato actúa como modulador positivo de la E1 y se une al sitio alostérico de E1 aumentando su actividad

26. Enzimas Alostéricas: Cinética • No se define KM y sí V máx que es el punto de saturación de la enzima donde todos los sitios se encuentran ocupados y la enzima trabaja a su máxima velocidad • La curva tiene forma sigmoidea a bajas concentraciones de S la enzima alostérica actúa a menor velocidad que la micheliana • En enzimas alostéricas hablamos de moduladores positivos o negativos que son usados por la célula para regular la actividad enzimática contribuyendo a preservar la homeostasia