Estudiante : Sofía Zamora Docente: Lic Geovanny Bonifaz Tema: Electroforesis de Hemoglobina

1. UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO CIENCIAS DE LA SALUD LABORATORIO CLÍNICO Estudiante : Sofía ZamoraDocente: Lic Geovanny BonifazTema: Electroforesis de Hemoglobina

2. Es un método que permite el desplazamiento de una molécula (con carga eléctrica neta) dentro de un campo eléctrico. La molécula con carga se mueve en dirección al electrodo con signo opuesto, separándose a medida que pasa el tiempo. • La velocidad (v) de migración de las moléculas dentro de un campo eléctrico depende de aspectos tales como: • a) la fuerza del campo eléctrico (E), • b) la carga eléctrica neta de la molécula (z), • c) el coeficiente de fricción de la molécula (éste depende de su tamaño y su forma).  ELECTROFORESIS

3. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas  en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir  cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará  este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado  las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía  cinética propia denominado  difusión.  La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.  FUNDAMENTO

4. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.   Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz  que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.

5. ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA • Es un examen que mide los diferentes tipos de Hb y permite identificar varios tipos de ella, los cuales implicar una enfermedad hemolítica. • Es el método de laboratorio de más ayuda para separar y medir hemoglobinas normales y ciertas anormales. • Se realiza este examen cuando existe un problema asociado con formas anormales de hemoglobina (hemoglobinopatía). • La hemoglobina, la proteína presente en los glóbulos rojos que transporta oxígeno, tiene varias formas moleculares, algunas normales y otras anormales.

6. PROCEDIMIENTO

7. Centrifugar 5 mL de sangre por 5 minutos a 3000 r.p.m. (para remover el plasma). • Lavar los eritrocitos con solución salina fisiológica, tres veces. Para esto se centrifuga cada vez por tres minutos a 3000 r.p.m. (remover el sobrenadante después de cada centrifugación. • Agregar 0.4 mL de cloroformo y agitar vigorosamente por 5 minutos. • Centrifugar por 15 minutos a 3000 r.p.m. • Separar el hemolizado del sobrenadante. PREPARACIÓN DE LA SANGRE

8. Colocar una tira de acetato de celulosa dentro de una cubeta conteniendo solución buffer (pH 8.6 - 9.2); dejar allí por 5 minutos. • Sacar la tira de la solución y eliminar el exceso de buffer. • Colocar la tira en la cámara de electroforesis , arreglar de forma que quede bien extendida. • Usar un capilar para aplicar las muestras en la tira de acetato de celulosa. • Añada suficiente buffer dentro de la cámara hasta que haga contacto con los extremos de la tira. PREPARACIÓN DE LA ELECTROFORESIS:

9. Corra la muestras por unos 30 minutos a 250 - 300 V. • Saque la tira, una vez que se cumpla el tiempo de corrida. • Tiña la tira con el Ponceau's durante 10 minutos (no agite). • Decolore la tira agitándola suavemente en un baño de ácido acético al 5% hasta que el fondo rojizo sea removido (se realizan tres baños sucesivos). • Secar la tira en un incubador por 10 minutos a una temperatura entre 60 - 100º C. • Observe la tira y aprecie las diferencias de movilizaciones de las hemoglobinas empleadas.

10. EQUIPOS

11. Hydrasys 2

12. Los resultados obtenidos con la estandarización de las 3 técnicas electroforéticas fueron satisfactorios. • Se realizó la electroforesis de Hb en medio alcalino a 1 446 pacientes: 931 (64,4 %) atendidos en el IHI; 423 (29,3 %) remitidos de otros hospitales, policlínicos y consultorios de La Habana y 92 (6,3 %) de otras provincias del país. Se cuantificó el porcentaje de Hb A en 93 enfermos con hemoglobinopatías que requirieron de exanguinotransfusión. A 193 enfermos se les cuantificó la Hb F; de ellos, el 75,2 % (n=140) mostraron valores elevados. Se determinaron los niveles de Hb A2 en 132 casos; en 20 (15,2 %) estaba aumentada y en 24 (18,2 %) disminuida. • En la figura 1 se muestra el resultado de una electroforesis de Hb. Se observan casos con el patrón normal (Hb AA) y otros con diferentes hemoglobinopatías estructurales. • Se diagnosticaron 149 portadores (heterocigóticos) de hemoglobinas anormales cualitativas; 60 enfermos, 24 pacientes con a talasemia o deficiencia de hierro y 20 con b talasemia heterocigótica. RESULTADOS

14. Se requiere una muestra de sangre venosa de 5 a 7 mL  en un tubo lavanda con EDTA. • En los adultos estas moléculas de hemoglobina a continuación hacen el total de hemoglobina: • Hb A1: 95% a 98% • Hb A2: 2% a 3% • Hb F: 0,8% a 2% • Hb S: 0% • Hb C: 0% Resultados normales (*):

15. Aunque se han descrito muchas moléculas diferentes de hemoglobina, las más comunes son HbA1, HbA2, HbF, HbS, HbC, Hgb H y Hgb M. En adultos normales, sólo la HbA1 y la HbA2 están presentes en niveles significativos. Se pueden presentar pequeñas cantidades de HbF (que es la mayor Hb presente en el feto), pero no ocasionan consecuencias, a menos que sus niveles sean superiores al 2% del total. • En los niños estas moléculas de hemoglobina a continuación hacen el total de hemoglobina: • Hb F (recién nacido): 50% a 80% • Hb F (6 meses): 8% • Hb F (después de 6 meses): 1% a 2%

17. La presencia de niveles significativos de hemoglobinas anormales puede indicar: • Anemia células falciformes o drepanocitosis • Enfermedad por hemoglobina C • Hemoglobinopatías raras. • Una de las condiciones adicionales bajo las cuales se puede realizar el examen es la Talasemia. Significado de los resultados anormales