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第六章 RNA 转录 ( RNA transcription )

第六章 RNA 转录 ( RNA transcription ). 6.1. 基本概念 6.2. 原核生物 RNA 转录的起始 6.3. 真核生物 RNA 转录的起始 6.4. 转录的延伸 6.5. 转录的终止 6.6. 原核生物转录产物的后加工 6.7. 真核生物转录产物的后加工 6.8. 真核生物转录产物中内元的去除 6.9. 不连续转录和反式拼接. 第一节 基本概念. 转录 (transcription): 是指以 DNA 为模板，在依赖于 DNA 的

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第六章 RNA 转录 ( RNA transcription )

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Presentation Transcript

  1. 第六章 RNA转录 (RNA transcription)

  2. 6.1. 基本概念 6.2. 原核生物RNA转录的起始 6.3. 真核生物RNA转录的起始 6.4. 转录的延伸 6.5. 转录的终止 6.6. 原核生物转录产物的后加工 6.7. 真核生物转录产物的后加工 6.8. 真核生物转录产物中内元的去除 6.9.不连续转录和反式拼接

  3. 第一节 基本概念

  4. 转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的 RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、 CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA 的过程。 在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。 • 若 干 基 本 概 念 • 是基因表达的第一步，也是最关键的一步。 • 以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板 (杂交实验所证实)

  5. 有义链 (sense strand) • [又称编码链 coding • strand]: • 指不作模板的DNA单链 • 反义链 (antisense strand) • [又称模板链 template • srand] : 指作为模板进行RNA转录的链 (60年代以前的表示方法与此相反)

  6. 在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录 • A＝U、C≡G 合成RNA分子 • 转录合成RNA链的方向为5’→3’，模板单链DNA的极性 方向为3’→5’， 而非模板单链的极性方向与RNA链相 同，均为5’→3’。（书写） • 基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA 为模板,RNA 聚合酶的结合)

  7. －10 ＋1 ＋10 upstream start point downstream • RNA 的转录包括 promotion. elongation. termination 三过程 • 从启动子 (promoter)到终止子(terminator)称为转录单 位 (transcription unit) (转录起始点) • 原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真 核生物中的转录单位多为monocistron, No operon • 转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游 记为正值

  8. 第二节 原核生物RNA转录的起始(RNA Transcription promotion in prokaryots)

  9. Absence of lactose z y a i p o Active No lac mRNA Presence of lactose z y a i p o Inactive -Galactosidase Permease Transacetylase 两个相关概念: ＊ 操纵元(operon): 是原核生物基因 表达调控的一个 完整单元，其中 包括结构基因、 调节基因、操作 子和启动子

  10. β α β α σ σ ＋ α β’ α β’ Core Enzyme Holo Enzyme • 启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别 • 并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还包括一些调节 • 蛋白因子的结合位点 (频率、效率) 一、原核生物的RNA polymerase (E. coli) 1、全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme)

  11. (1) 全酶（Holo Enzyme） • 用于转录的起始 • 依靠空间结构与DNA模板结合 (σ与核心酶结合后 引起的构象变化) • 专一性地与DNA序列(启动子)结合 • 结合常数：1014／mol • 半衰期：数小时 （107／mol 1秒以下） • 转录效率低，速度缓慢（ σ的结合）

  12. （2） 核心酶 （Core Enzyme） • 作用于转录的延伸过程（终止） • 依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性 基团与DNA的磷酸根之 间） • 非专一性的结合（与DNA的序列无关） • 结合常数：1011／mol • 半衰期：60秒

  13. （3）全酶的组装过程 2 α＋ β α2 β＋ β’ α2ββ’＋σ α2ββ’σ 此外，新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚。 2、各亚基的特点和功能 （1） σ因子 • σ因子可重复使用 • 修饰RNApol构型 • 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(－35区), 并通过σ与模板链结合

  14. • 不同的σ因子识别不同的启动子 E.coli 中有五种σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28、 σ24） 枯草杆菌中有11种σ因子 （σ因子的更替对转录起始的调控） （2）α因子 • 核心酶的组建因子 α＋α 2α＋βα2β＋β’ • 促使RNApol 与DNA模板链结合 • 前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链 • 尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链

  15. （3） β因子 • 促进RNApol＋NTP RNA elongation • 完成NMP之间的磷酸酯键的连接 • Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基） • 与Rho （ρ）因子竞争RNA 3’－end

  16. • 构成Holoenzyme 后，β因子含有两个位点 I site（initiation site . Rifs）: 该位点专一性地结合 ATP或者GTP （需要高浓度的ATP或GTP） E site（elongation site. RifR）:对NTP非专一性地结 合（催化作用和Editing功能） （4） β’ 因子 • 参与RNA非模板链（sense strand）的结合 （充当SSB）

  17. 由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点 • 有义DNA链结合位点（β’亚基提供） • DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供） • 双链DNA解链位点（前端 α亚基提供） • 单链DNA重旋位点（后端α亚基提供） • σ因子作用位点

  18. E. coli RNA polymerase 155 KD 36.5 KD 11 KD 36.5 KD 70 KD 只用于起始 151 KD 用于起始和延伸

  19. 二、启动子（promoter）的结构与功能 （Prok.E.coli） 1、启动子由两个部分组成 （1） 上游部分— CAP-cAMP结合位点 （基因表达调控的正控制位点） CAP（catabolite gene Activator Protein） 降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白 （2） 下游部分— RNApol的进入（结合）位点 －35 ~ －10 包括识别位点和结合位点（R B位点）

  20. 2、 RNA聚合酶的进入位点 （1） Sextama 框（Sextama Box） § -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点， § RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点 —识别位点（R位点） § 大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 § 重要性:很大程度上决定了启动子的强度 （RNApol 的σ因子） §位置在不同启动子中略有变动

  21. 保守T （2） Pribonow 框（Pribonow Box） § -10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点（B 位点） § 一致序列：T80A95T45A60A50T96 （TATPUAT） 因此又称TATA Box § 位置范围 －4 到－13

  22. （3） 起始位点（initiation site）：＋1位点 RNA聚合酶的转录起始位点 起始NTP多为ATP或GTP

  23. 起始过程 ： a. 全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 （R位点被σ因子发现并结合 ）

  24. b、 开放型启动子复合物的形成 § RNApol的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富 含A·T的Pribnow 框的“熔解”， 形成12－17bp的泡状 物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合 § 开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向 § 两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA ）

  25. G C T A ---6-9 bp--- TTGACA -----16-18 bp------- TATAAT -35 sequence -10 sequence +1 c. 在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（β亚基） 三元复合物形成 +1位多为CAT模式,位于离开保守T 6~9 个核苷酸处 （4） σ因子解离→核心酶与DNA的亲和力下降 起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程

  26. 转录的起始过程 σ 核心酶 12～17bp

  27. （β亚基）

  28. 3、 CAP-cAMP 结合位点 （也称CAP位点） 转录调控中，I → 阻遏蛋白 → 负调控 lac操纵子模型

  29. I

  30. 许多基因的表达还存在正调控机制 例如: E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时 → 只有葡萄糖被 利用 原因：CAP位点的正调控 • 葡萄糖缺少时 ，腺苷酸环化酶将ATP → cAMP， cAMP与CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能 与RNApol结合 • 葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAP－cAMP 与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结 合RNApol

  31. 因此,一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开,结构基因才 能进行转录。 （对 lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录） （1）CAP位点的组成 （－70 ～ －40） 位点Ⅰ：－70 ～ －50 包括一个IR 序列 强结合位点 位点Ⅱ：－50 ～ －40 弱结合位点 位点Ⅰ对位点Ⅱ具有协同效应（cooperativity）

  32. （2） 位点Ⅱ结合CAP－cAMP复合物后，促使RNApol进入 Sextama Box,最终与－10序列结合起始转录 原因：CAP－cAMP复合物与位点Ⅱ结合 → Sextama Box 富含G·C区域（G·C岛区）稳定性降低 → Pribnow Box 的溶解温度降低 →促进开放型启 动子复合物的形成 →促进转录

  33. 4、RNApol 在DNA上结合位点的鉴定 DNase 法----------40bp 而足迹法（footprinting）结果相对准确 足迹法原理： • 限制酶切割结合有RNApol的DNA →大分子DNA • 末端标记该DNA（Klenow片段标记3’,碱性磷酸酯 酶标记5’） • 用内切酶降解DNA（控制反应条件） • 凝胶电泳分离，放射自显影观察

  34. 限制酶切 分离 大片段DNA

  35. 末端标记大分子DNA 重新结合RNApol 作对照 直接用DNase 进行降解 用微量DNase降解 电泳 电泳

  36. • 用足迹法鉴定出来的 RNApol 与DNA的结合区域为 +20 ~ －50（－40），大约 60 ~ 70 bp • 实验中还发现…………….. 5、 启动子各位点与转录效率的关系 （1）－35 序列与－10 序列与转录效率的关系 标准启动子 －35 TTGACA －10 TATAAT

  37. 则不同的启动子 a. 与标准启动子序列同源性越高 →启动强度越大 b. 与标准启动子同源性越低 →启动强度越小 c. 与标准启动子差异很大时 →由另一种σ因子启动 原因: • －35序列通过被 σ因子识别的容易 → 决定启动子强度 • －10序列影响开放型启动子复合物形成的速度 → 决定启动子强度

  38. • 启动子上升突变、启动子下降突变 （2） －35序列与－10序列的间隔区与转录效率的关系 ◆ 碱基序列并不重要 ◆ 间距非常重要，17bp的间距转录效率最高 ◆ 间距上的突变种类： 间距趋向于17bp → 上升突变 间距远离17bp → 下降突变

  39. E.Coli各σ识别的启动子的序列 δ24 δ54 δ28

  40. 第三节 真核生物RNA转录的启动 RNA Transcription promotion in Eukaryots

  41. 一、真核生物的RNApol 1、 三种RNApol： 根据对α - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApolⅠ 最不敏感 （动、植、昆） RNApol Ⅱ 最敏感 RNApol Ⅲ 不同种类（物种）的敏感性不同 2、 位置和转录产物 RNApolⅠ核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、 28S）

  42. RNApolⅡ核质 主要负责 hnRNA、snRNA的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA） snRNA（核内小分子 RNA small nulear RNA) RNApol Ⅲ核质 负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和 部分 snRNA •目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低）

  43. 3、亚基组成： 分子量500KDa,含两个大亚基和 7~12 个(4-8)小亚基 RNApolⅡ： • 大亚基中有 C 末端结构域 (carboxy terminal domain CTD) • CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－Ser C 端重复七肽 • 不同生物中重复数目不一样（酶活性）

  44. • CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol Ⅱ被称为ⅡA 非磷酸化的 RNApol Ⅱ称为ⅡB • CTD参与转录 → ⅡB → ⅡA → 使 RNApol易于离开 启动子进入延伸过程（10倍） 二、 真核生物的启动子 三种 RNApol → 三种转录方式 三种启动子 → 三类基因，Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类

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