Técnicas em Imunologia

1. Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia Prof.Doutor José Cabeda

2. Ensaios Liquídos (ensaios homogéneos) Difração da luz Nefelometria turbidimetria Outros ensaios liquidos EMIT CEDIA Imunofluorescência Aglutinação Quimioluminescência Ensaios Sólidos (ensaios heterogéneos) ELISA Competitivo Não-competitivo indirecto RIA Técnicas baseadas em imunoglobulinas Prof. Doutor José Cabeda

3. Nefelometria Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes 31º permite melhor razão sinal/ruído Imunoturbidimetria Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada Técnicas baseadas na difracção da luz Prof. Doutor José Cabeda

4. Curva de imunoprecipitação • Assumindo: • Ig pelo menos bivalentes IgG • Antigénio com pelo menos 2 epitopes • Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção • Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação • A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso Prof. Doutor José Cabeda

5. Cinética da Curva de imunoprecipitação • A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio • A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reacção Prof. Doutor José Cabeda

6. Rate Nephelometry • [Ab] é constante • Aumento progressivo da [antigénio] • Deve ser realizada na zona de excesso de Ab • Em nefelómetros automáticos deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: • São testadas novas [] • É testada o excesso de antig Prof. Doutor José Cabeda

7. End-point nephelometers • Medida no ponto máximo da reacção • Medida de branco ou no inicio da reacção • Valor interpolado de uma curva de calibração • Variações • Particle enhanced Prof. Doutor José Cabeda

8. Particle enhanced nephelometry • São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio competidor • Aumento de sensibilidade Prof. Doutor José Cabeda

9. Ensaios • Requisitos • Qualquer fluido • Soro • Plasma • Urina • CSF • Deve ser diluído (para não interferir na leitura) • Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugação • Amostras ictéricas ou hemolisadas • Não afectam a nefelometria • Afectam a turbidimetria Prof. Doutor José Cabeda

10. CEDIA (Cloned enzyme donor assay) B-galactosidade em 2 fragmentos inactivos enzyme donnor Enzyme acceptor A reacção imune junta-os activando a enzima. Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima inactivando-a EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) Aumento ou diminuição da actividade enzimatica com a reacção Ag-Ab Outro ensaios homogéneos Prof. Doutor José Cabeda

11. Imunofluorescência • Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes • Conjugado utilizado como revelador directo • Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade • Grande aumento na rapidez de detecção • Vantagens relativamente à RIA: • Tão sensivel • Reagentes mais estáveis • Mais fácil de implementar Prof. Doutor José Cabeda

12. Principais fluorocromos utilizados Prof. Doutor José Cabeda

13. Técnicas de imunofluorescência (I) • Directas • Anticorpo directamente conjugado • Indirectas • Anticorpo secundário conjugado • Acopladas • Duas reacções acopladas • Fluorescence polarization immunoassay • Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexo Prof. Doutor José Cabeda

14. Técnicas de imunofluorescência (II) • Fluorescent Quenching assay • Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa • Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar) • A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpo • A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpo • Método indirecto Prof. Doutor José Cabeda

15. Técnicas de imunofluorescência (III) • Substrate labelled Fluorescent immunoassay • Método indirecto • Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado • Actividade do modulador influenciada pela ligação do Ab Prof. Doutor José Cabeda

16. Técnicas de imunofluorescência (IV) • Fluorescent energy transfer immunoassay • Método competitivo • Analito conjugado com FITC • Anticorpo ligado a Rodamina • Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodamina • Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodamina Prof. Doutor José Cabeda

17. Autofluorescencia Proteinas do soro (320-350nm) Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha de base Para obviar a estes problemas pode-se Tratar a amostra com Enzimas proteoliticas Agentes oxidantes Agentes desnaturantes Quenching Bilirrubina Hemoglobina Fotodestruição Diminuição da fluorescência ao longo da excitação Problemas da imunofluorescência Prof. Doutor José Cabeda

18. Aglutinação • Baseada na reacção ag-ab • Observada visualmente • Tipos: • Directa (ABO) • IgM aglutina várias RBC • IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte • Indirecta ou passiva • Antigénio ligado a subtância inerte • Reversa • Anticorpo ligado a substância inerte Prof. Doutor José Cabeda

19. Aglutinação de partículas • Mais sensiveis que a aglutinação • Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas • Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex • Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução • A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar Prof. Doutor José Cabeda

20. Ensaio quimioluminescente • Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção de oxidação-redução • O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10-18 a zeptomole=10-21) • Compostos utilizados: • Esteres de acridina (detecção do NaOH e H2O2) • Limite de detecção de 0.5 atomoles • Derivados do isoluminol (detecção com H2O2 e um catalizador) • Limite de detecção de 50 atomoles Prof. Doutor José Cabeda

21. Enzimas utilizadas em ensaios Quimioluminescentes Prof. Doutor José Cabeda

22. Ensaios em fase sólida • ELISA • Competitivo • Não competitivo-indirecto Prof. Doutor José Cabeda

23. Ensaios em fase sólida • ELISA • Sandwich ou de captura Prof. Doutor José Cabeda

24. Resolver problemas do ELISA Prof. Doutor José Cabeda

25. Electroforese de Imunoglobulinas • Electroforese em agarose de alta resolução • Imunofixação • Imunosubtracção • Electroforese capilar Prof. Doutor José Cabeda

26. Electroforese de Ig em agarose Electroforese + Corar com Ponceau S e secar Prof. Doutor José Cabeda

27. Imunofixação • Electroforese • Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente • Proteinas não pp são lavadas • Corar os pp com amido black nigrosin Prof. Doutor José Cabeda

28. Imunosubtracção Prof. Doutor José Cabeda

29. Crioglobulinas (I) • Tipo I • Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) • Tipo II • Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) • Tipo III • Policlonal Prof. Doutor José Cabeda

30. Crioglobulinas (II) Prof. Doutor José Cabeda