1. (Fito)hormony i przewodzenie sygnałów u roślin Phytohormones and Signal Transduction (ST) in plants

2. Hormony roślinne • Związki organiczne o niewielkiej masie cząsteczkowej, które wpływają na odpowiedź fizjologiczną na bodźce środowiskowe, działają w niewielkich stężeniach (zwykle poniżej 10-7 M). Nie są bezpośrednio zaangażowane w procesy metaboliczne i rozwojowe, ale wpływają na ich przebieg i kierunek. • Hormony roślinne są stosowane na dużą skalę w rolnictwie, ogrodnictwie i biotechnologii, do modyfikowania wzrostu i rozwoju roślin. • Regulują lub integrują wiele procesów komórkowych i fizjologicznych w tym: Podział komórkowy, Wzrost komórek na objętość, Różnicowanie komórek, Kwitnienie, Dojrzewanie owoców, Ruch (tropizmy), Spoczynek nasion, Kiełkowanie nasion, Starzenie się, Opadanie liści, Przewodzenie szparkowe

3. Hormony roślinne Tylko małe cząsteczki Produkowane w całej roślinie Działają głównie na cele lokalne (sąsiadujące komórki i tkanki) Efekty danego hormonu różnią się w zależności od interakcji z innymi hormonami Brak centralnej regulacji Roślinne regulatory wzrostu? Hormony zwierzęce Peptydy/białka oraz małe cząsteczki Produkowane w wyspecjalizowanych ‘gruczołach’ Działają głównie na cele odległe Efekty danego hormonu silnie specyficzne Regulowane przez centralny system nerwowy Czy termin ‘hormon’, w odniesieniu do substancji roślinnych, jest uzasadniony?

4. Główne klasy hormonów roślinnych Auksyny Cytokininy Gibereliny Kwas abscysynowy (ABA) Etylen Substancje ‘hormono-podobne’ produkowane przez rośliny Poliaminy Kwas jasmonowy Kwas salicylowy Brassinosteroidy Florigeny Fitochrom (fotoreceptor) Tlenek azotu Klasyfikacja hormonów roślinnych

5. Auksyny • Stymuluje: wydłużanie komórek, podział komórek w kambium, i w kombinacji z cytokininami, w kulturach tkankowych, różnicowanie elementów naczyniowych, inicjację korzenia na uciętej łodzydze, inicjację korzeni w kulturach tkankowych. • Pośredniczy w odpowiedziach tropicznych (zaginanie pędu/korzeni) w odpowiedzi na światło i siłę ciężkości. • Wytwarzana w stożku wzrostu, hamuje pąki boczne. • Opóźnia starzenie liści • Może hamować lub promować (poprzez stymulację etylenem) opadanie liści i owoców. • Indukuje zawiązywanie i wzrost owocu (u niektórych roślin) • Opóźnia dojrzewanie owoców • Stymuluje wzrost organów kwiatu • Stymuluje wytwarzanie etylenu IAA- kwas indolilo-3-octowy, pochodna tryptofanu

6. Auksyna wytwarzana w nasionach powoduje wzrost owocu Rozwój normalny Auksyna dodana po usunięciu nasion Po usunięciu nasiion

7. Cytokininy • Stymulują: podziały komórkowe • Stymulują morfogenezę – inicjację pędu/tworzenie pąka w kulturach tkankowych • Stymulują wzrost pędów bocznych – likwidują dominację apikalną. • Stymulują ekspansje liści wynikającą z powiększania komórek. • U niektórych gatunków wzmagają otwieranie aparatów szparkowych. • Stymulują przekształcenie etioplastów w chloroplasty poprzez stymulacje syntezy chlorofilu. Zeatyna, pochodna adeniny

8. Współdziałanie i anatgonizm auksyny i cytokininy Auksyna Cytokinina (kinetyna)

9. Gibereliny • Stymuluje: • wydłużanie pędu przez stymulację podziałów i wydłużania komórek. • wypuszczanie pędu kwiatowego i kwitnienie w długim dniu • Przerywa spoczynek nasion u roślin wymagających stratyfikacji lub światła do indukcji kiełkowania. • Stymuluje wytwarzanie enzymów (a-amylazy) w kiełkujących ziarnach zbóż w celu mobilizacji rezerw nasienia. • Może powodować partenokarpiczny rozwój owocu (bez nasion). • Może opóźniać starzenia w liściach i owocach cytrusów.. GA3 – kwas giberelinowy

10. Fenotypy mutantów Arabidopsis w genach kodujących receptory: auksyny i gibereliny • A. Roślina dzika (wt) ( z prawej) i poczwórny mutant w genach kodujących elementy receptora ( z lewej) • B. podziały komórkowe w hypophysis (zaczątek korzenia i czapeczki) silnie ograniczone (z prawej) w porównaniu z wt. • C. Mutant w genie gid1 (receptor giberelin) u ryżu ( z lewej), wt – z prawej (insert – powiększenie mutanta). Wzrost w mutancie silnie ograniczony.

11. ABA • Stymuluje zamykanie szparek (susza indukuje syntezę ABA). • Hamuje wzrost pędu, ale nie korzenia (może nawet stymulować wzrost korzenia). • Indukuje syntezę białek zapasowych w nasionach. • Hamuje efekt giberelin na syntezę de novoα-amylazy. • Wywiera pewien wpływ na indukcję i utrzymywanie spoczynku nasion. • Indukuje transkrypcję genów, w szczególności kodujących inhibitory proteinaz, w odpowiedzi na zranienie (to tłumaczy rolę w obronie przed patogenami). Kwas abscysynowy, pochodna szlaku terpenoidów

12. H2C=CH2 Wytwarzany z aminokwasu metioniny poprzez cykliczny pośrednik (kwas 1-aminocyklopropano karboksylowy – ACC) Stymuluje wychodzenie ze spoczynku. Stymuluje wzrost, różnicowanie pędu i korzenia. Stymuluje opadanie liści i owoców. Stymuluje otwieranie kwiatów. Stymuluje starzenie kwiatów i owoców. Stymuluje dojrzewanie owoców. Etylen

13. Fenotypy mutantów w genach kodujących receptory fitohormonów • Mutanty w receptorach (w porównaniu z wt): • A. Brassinosteroidów • B. Etylenu • C. Cytokininy • D. Cytokininy ( pokrój) • D – Cytokininy - przekształcone komórki wiązek korzeniowych –dół. • E. ABA (mutant w genie fca – z prawej) kwitnie później.

14. Mechanizm działania auksyn i giberelin Receptor auksyny Kompleks proteasomu Receptor gibereliny Białko Della

15. Jeden z domniemanych receptorów ABA • Przy niskim stężeniu ABA, FCA i FY oddziałują i wspólnie zapobiegają nagromadzaniu się FLC, negatywnego regulatora kwitnienia • Oddziaływanie ABA z FCA odblokowuje FLC

16. Szlaki sygnałowe etylenu i cytokininy Białko „histidine phosphotransfer protein”

17. Potencjalne sensory stresów abiotycznych (chłód, susza, zasolenie)Dwuskładnikowa kinaza histydynowa • Dwuskładnikowy system transferu fosforanu • Składa się z dimerycznego transbłonowego sensora – kinazy histydynowej (składnik I)- termosensor i cytoplaz- matycznego regulatora odpowiedzi (składnik II). • Domena kinazowa dwuskładnikowej kinazy histydynowej jest modułem 250-aminokwasowym,z czterema konserwowanymi blokami sekwencji ulokowanymi w domenie wiążącej ATP (N, G1 , F i G2).

18. Hormonalna regulacja kiełkowania

19. Przewodzenie sygnałów (Signal Transduction)-podstawowe pojęcia • ST = proces przetwarzana jednego rodzaju sygnału (bodźca) w inny. • Czas: ST obejmuje procesy trwające od milisekund do sekund. • Kaskada sygnałowa (szlak wtórnych przekaźników) = bodziec inicjujący łańcuch wydarzeń obejmujących wiele enzymów i innych cząsteczek. Efekt: słaby bodziec uwalnia silną odpowiedź. • ST u jednokomórkowców – spektrum sposobów reakcji na zmienne warunki środowiska • ST u wielokomórkowców – ma podłoże w procesach na poziomie komórki. Inne mechanizmy reakcji na bodźce, rośliny vs zwierzęta.

20. Ogólny schemat szlaku przewodzenia sygnału 1) Odebranie sygnału; 2) Uruchomienie (indukcja) pierwszej grupy wtórnych przekaźników (np. fosforany inozytolu, reaktywne formy tlenu - ROS); 3) Modulacja przez wtórne przekaźniki pierwszej grupy poziomu wtórnych przekaźników następnej grupy, np. poziomu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ ; 4) Inicjacja (na ogół) kaskady fosforylacji białek; 5) Docelowa modyfikacja (na ogół przez fosforylację/defosforylację) białek bezpośrednio zaangażowanych w ochronę komórki lub będących czynnikami transkrypcyjnymi kontrolującymi specyficznie reagujące na dany sygnał (np. stres) zestawy genów; 6) Udział produktów tych genów w wytwarzaniu substancji regulatorowych, np. hormonów roślinnych (ABA), etylenu, czy kwasu salicylowego (S.A.)

21. Ogólny schemat przewodzenia sygnałów u roślin na przykładzie reakcji na stresy abiotyczne (zimno, susza, zasolenie)

22. Pierwotna indukcja przekaźników wtórnych może indukować wtórne pętle sygnałowe

23. Sygnały/bodźce zewnątrzkomórkoweRodzaje, sposób działania • Cząsteczki substancji obecne w środowisku komórki. Temperatura, światło, siła osmotyczna, prąd elektryczny, ciśnienie, zranienie. • Większość substancji w zewnętrznym środowisku ma hydrofilowy charakter, nie przechodzi przez błonę komórkową (wyjątek, np. steroidy), ale może z nią oddziaływać. Bardzo wiele wiąże się (dokowanie) do białek receptorowych w błonie, posiadających wystające na zewnątrz domeny, co indukuje zmiany w konformacji całej cząsteczki przenoszące się do domeny wewnętrznej i inicjuje wydarzenia wewnątrz komórki. • Receptory są b. specyficzne w stosunku do ligandów. Nawet drobna zmiana w budowie ligandu uniemożliwia wiązanie. Substancje o budowie bardzo zbliżonej do rzeczywistych ligandów mogą być inhibitorami.

24. Rośliny potrzebują wielu sensorów, aby wyczuwać stresy abiotyczne • Podstawowe stresy abiotyczne: niska temperatura, susza i wysokie zasolenie oddziałują na wiele różnych elementów komórki. • Niska temperatura, susza: ograniczenie mechaniczne, zmiany aktywności makrocząsteczek, zmniejszony potencjał osmotyczny środowiska komórkowego • Wysokie zasolenie: zmiany w przewodnictwie jonowym, zmiana warunków osmotycznych. • Nie istnieją pojedyncze wyspecjalizowane sensory stresów abiotycznych. Pojedynczy sensor może jedynie regulować odnogę drogi sygnałowej reagując na wybrany element działania stresu (np. niska temperatura zmienia płynność błony. Sensor wykrywający tę zmianę inicjuje kaskadę sygnałową w odpowiedzi na zmianę płynności błony, ale nie kontroluje sygnalizacji zainicjowanej przez wewnątrzkomórkowe białko, którego konformacja lub aktywność została zmieniona przez niska temperaturę).

25. Potencjalne sensory stresów abiotycznych (chłód, susza, zasolenie)Ca 2+ • Wszystkie trzy stresy indukują przejściowy wpływ Ca 2+ do cytoplazmy - kanały odpowiedzialne za wpływ Ca 2+ są jednym z potencjalnych sensorów (temperatura, płynność błony, przebudowa cytoszkieletu)

26. Kanał wapniowy w błonie komórkowej

27. Sygnały wewnątrzkomórkowe(wtórne przekaźniki) • Heterotrimeryczne białka G • Małe GTPazy • Cykliczne nukleotydy (cAMP, cGMP) • Jony wapnia (Ca 2+ ) • Reaktywne formy tlenu (ROS) • Pochodne fosfoinozytoli: trifosforan fosfatydyloinosytolu (PIP 3) , trifosforan inozytolu (IP 3) • Diacyloglicerol (DAG), • Różne kinazy i fosfatazy białkowe Sygnałami indukowanymi wtórnie mogą być także hormony roślinne

28. Białka G • Pełna nazwa białek G ( G protein) to „białka wiążące GTP (GTP-binding protein), ponieważ w stanie aktywnym wiążą GTP (trifosforan guanozyny).  Istnieją dwa rodzaje białek G: heterotrimeryczne białka G i monomeryczne białkaG (small G proteins). Receptory sprzężone z białkiem G są sprzężone z heterotrimerycznym białkiem G

29. W skład heterotrimerycznego białka G wchodzą trzy podjednostki: α, β i γ.  W stanie nieaktywnym podjednostka α jest związana z GDP

30. Cykl aktywacji i deaktywacji heterotrimerycznego białka G

31. Różnorodne szlaki przekazywania sygnałów związanez receptorami sprzężonymi z białkiem G

32. Cykliczne nukleotydy • cAMP i cGMP występują u roślin i odgrywają rolę w regulacji błonowych kanałów jonowych

33. Kanały dla jonów jednowartościowych

34. Fosforany inozytolu

35. Uproszczony schemat transdukcji sygnałów u zwierząt

36. Główne typy sygnalizacji w stresach abiotycznych

37. Kinazy białkowe MAP w sygnalizacji u zwierząt

38. Indukcja syntezy kwasu abscysynowego (ABA) jako rezultat przekazywania sygnałów w stresie abiotycznym

39. Sieć regulatorowa ekspresji genów w odpowiedzi na chłód, stres osmotyczny (np. susza) i wysokie zasolenie (K. Nakashima and K. Yamaguchi-Shinozaki) Tested genes

40. Przekazywanie sygnałów w komórkach szparkowych (guard cells) • GC umożliwiają funkcjonowanie otworów w aparatach szparkowych w epidermie liści i pędów. Otwory kluczowe dla pobierania CO2 do lisci do fotosyntezy. W zamian, rośliny tracą tą drogą do atmosfery (transpiracja) 95% posiadanej wody. • Mechanizmy przewodzenia sygnałów w GC integrują bodźce hormonalne, sygnały świetlne, status wody, CO2, temperatury i innych warunków środowiska aby modulować otwarcie szparki w celu regulacji wymiany gazowej i transpiracji. • GC stanowią zaawansowany model badawczy przewodzenia sygnałów u roślin.

41. Zamykanie szparek • ABA syntetyzowany w odpowiedzi na stres suszy, inicjuje zamykanie szparek i hamuje ich otwieranie. • Inne czynniki powodujące zamykanie: ciemność i wzrost stężenia CO2

42. Przewodzenie sygnałów świetlnych i otwieranie szparek • Otwieranie szparek napędzane jest usuwaniem H+ za pośrednictwem protonowej (H+)-ATPazy błonowej, aktywowanej auksyną, światłem czerwonym i światłem niebieskim. • GC mają autonomiczne receptory światła indukujące otwarcie szparek. • Aktywacja (H+)-ATPazy błonowej przez te receptory powoduje hiperpolaryzację błony komórkowej, co wywołuje pobieranie K+via specyficzne kanały pobierające K+ do środka. Równolegle, stymulacja metabolizmu skrobi prowadzi do akumulacji w GC aktywnego osmotycznie bursztynianu. Dodatkowo, w GC rośnie poziom sacharozy. W początkowym okresie dnia głównym elementem podtrzymującym otwarcie jest K+, w późniejszym natomiast sacharoza.

43. Niektóre mediatory w szlaku sygnalizacji związanym z regulacja otworów szparkowych przez ABA

44. Rola ABA - schemat

45. Mechanizm reakcji stresowej u roślin

46. Oznaczenia niektórych czynników w szlaku ABA • AtRac1 – GTPaza z rodziny Rho • ROS – reaktywne formy tlenu • S1P – fosforan sfingozyny • ICa2+ - błonowy kanał wapniowy • MAPK – kinaza MAP • AAPK – kinaza białkowa aktywowana ABA • Ga – podjednostka a heterotrimerycznego białka G • Nt-Syr1 – syntaksyna związana z wędrówka przez błony • PLC – fosfolipaza C • PLD – fosfolipaza D • cADPR – cykliczna adenozynodifosforyboza • IP6 – heksafosforan inozytolu • ABH2 – białko wiążące się do czapeczki (cap) mRNA • ABI1 i ABI2 – fosfatazy fosfobiałek

47. HD2A PIRIN SAHH CobW PRL2 AMIDASE ATSWI3C AtBRM Farrona et. al., 2004 ATSWI3D ATSWP73A HD2B PRL1 BSH XRCC4 AKIN 10/11 ATAF2 ATSWI3A ATSWI3B MTO3 E3 AAA FCA BIP7 (11-17) ATGP4 RPT3 Proteins studied in Csaba Koncz’ laboratory BIP6 (11-16) JMJC Core subunits of the SWI/SNF chromatin remodeling complex except for ATPase plus the FCA protein BIP1 (1-57) Interactions identified In Csaba Koncz’ laboratory BIP2 (3-32) ARM Interactions verified in pGBT9/pGAD424 system SRC2 RPL12 BIP3 (3-45) ATPase Interactions verified in pGBT9/pACT2 system COP9 BIP5 (1-30) ANAC102 EBF1 Weak interactions identified in pGBT9/pACT2 system BIP4 (3-46) esterase family protein Di19 Proteins identified through the yeast two hybrd screen Interactions identified by other researchers from our laboratory in the pGBT9/pGAD424 system

48. Analysis of 9 days old atswi3c-1 seedlings on 1/2 MS medium containing different ABA concentration wt atswi3c-1 0,0 0,5 1,0 2,0 μM ABA Wniosek: mutant atswi3c jest nadwrażliwy na ABA

49. Germination of atswi3c-1 mutant on gibberellins, 10 days old seedlings Gibberellins 5 mg/l wt atswi3c-1 - gib + gib - gib + gib Wniosek: mutant atswi3c reaguje normalnie na gibereliny

50. Example of ethylene hypersensitivity 5 mm Figure 1. Dark-grown eer1 seedlings have an enhanced ethylene response when exposed to the ethylene precursor ACC. Dark-grown wild-type and eer1seedlings treated with either 10 mM AVG, 0 mM ACC (nt, no treatment), or 10 mM ACC for 3.5 d. 5 mm The Arabidopsis eer1 Mutant Has Enhanced Ethylene Responses in the Hypocotyl and Stem1 Paul B. Larsen2 and Caren Chang* Plant Physiology, February 2001, Vol. 125, pp. 1061–1073, 5 mm 5 mm 5 mm