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Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan Responsável Institucional: Karina Gramacho

Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan Responsável Institucional: Karina Gramacho Instituição Hospedeira: Ceplac/Cepec Departamento: Seção de Fitopatologia Instituição Parceira: UESC/DCB Área: Agronegócios/Cacau.

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Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan Responsável Institucional: Karina Gramacho

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Presentation Transcript

  1. Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan Responsável Institucional: Karina Gramacho Instituição Hospedeira: Ceplac/Cepec Departamento: Seção de Fitopatologia Instituição Parceira: UESC/DCB Área: Agronegócios/Cacau

  2. Caracterização molecular da resistência do cacaueiro (Theobroma cacao L.) à vassoura de bruxa e à podridão parda* *Projeto financiado pela FAPESB – Convênio 76/2002-Prodoc 1

  3. Objetivos do Projeto • Identificar e caracterizar molecularmente genes associados à resistência de frutos de cacau à vassoura de bruxa (VB) • Construção de primers específicos para genes de resistência visando a seleção indireta de plantas resistentes • Caracterização de diferentes acessos de cacaueiro quanto à presença/ausência de genes de resistência

  4. Introdução • Em 1989 foi detectado o primeiro foco de vassoura de bruxa no sul da Bahia • Em 1990, o Brasil era o segundo maior produtor mundial de cacau • Em conseqüência do avanço dessa doença, o Brasil caiu para o sexto lugar no ranking e passou de exportador a importador de cacau • O que resultou em mudanças no uso da terra, venda de propriedades, aumento do desemprego e danos ao meio ambiente • Em 2005, a lavoura recuperou-se um pouco, principalmente devido a clonagem de plantas resistentes à doença

  5. Fonte: Revista Veja, 26 de abril de 2006

  6. Material e Métodos • Foram inoculados com Crinipellis perniciosa (Cp) frutos de três variedades de cacau: -TSH1188 resistente a VB -TSH565 medianamente resistente -Catongo suscetível • Com polinização controlada, e cerca de 40 dias de idade

  7. Foram testadas diferentes formas de inoculação (copinho de massa de modelar, disco de papel filtro, e spray), utilizando-se diferentes concentrações de inóculo (1x105; 2x105; e 1x106 esporos/mL

  8. Após a inoculação, os frutos foram ensacados, e amostras da casca dos frutos foram coletadas, no local inoculado, com três repetições, nos seguintes intervalos de tempo: 24, 48, e 72 horas; 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 dias

  9. As amostras de casca colhidas foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido, identificadas, e armazenadas em freezer -80ºC

  10. Posteriormente, as amostras colhidas nos diferentes intervalos de tempo, foram moídas conjuntamente em nitrogênio líquido, mas separadamente por variedade

  11. O RNA da casca dos frutos de TSH-1188 inoculado com Cp foi extraído, sendo aplicado em gel de agarose 1% para verificar a qualidade do mesmo

  12. A biblioteca de cDNA de casca de fruto TSH-1188 inoculado com Cp, foi construída utilizando-se o Kit Creator Smart cDNA Library Construction (Clontech)

  13. A biblioteca de TSH-1188 inoculado com Cp foi plaqueada em meio LB contendo Cloranfenicol, as melhores colônias foram selecionadas, transferidas para 40 microplacas de 96 poços, sendo a seguir feitos os minipreps e reações de sequenciamento

  14. As 10 primeiras microplacas foram seqüenciadas no MegaBace (Amersham) da UESC • E outras 30 microplacas foram sequenciadas no ABI3100 (Applied Biosystems) do CEPEC/CEPLAC, adquirido com recursos do FINEP

  15. As 3.840 seqüências obtidas, a partir da biblioteca de cDNA de casca de frutos TSH-1188 inoculados com Cp, foram analisadas no Laboratório de Bioinformática da UESC, por Nicolas Carels, tendo sido selecionadas 1.274 (33%), que preenchiam os seguintes pré-requisitos: - qualidade Phred>10 - seqüências com comprimento >90pb - não correspondiam a seqüência do vetor - não correspondiam a cauda polyA

  16. Essas 1.274 seqüências selecionadas formaram 191 Contigs e 675 seqüências simples não redundantes, sendo 866 a soma de ambos • As 866 seqüências foram comparadas com os seguintes bancos de dados públicos: • Proteínas não redundantes “nr” através do Blast-X (GenBank - NCBI) • ESTs de Cacau Verica et al. 2004 (Plant Cell Reports, 23:404-413) • ESTs de Cacau de Jones et al. 2002 (Planta, 216:255-264)

  17. Resultados Alcançados Sintomas de VB emTSH1188 Inoculado TSH1188 Inoculado Assintomático

  18. Sintomas de VB em Catongo Inoculado com Cp na concentração 1x105 esporos/mL pelo método do copinho

  19. Sintomas de VB em Catongo Inoculado com Cp na concentração 1x106 esporos/mL, pelo método do Spray

  20. Comparação com o Banco de Dados de Proteínas Não Redundantes “nr” (Blast-X) • Das 866 sequências estudadas: - 552 (64%) apresentaram homologia com “nr” - 314 (36%) não mostraram homologia (no hits) • Das 1.274 sequências previamente selecionadas: - 11 (0,9%) tiveram homologia com sequências de proteínas de fungos - Destas 11, apenas 9 (0,7%) apresentaram homologia com as sequências do banco de dados do genoma de Crinipellis perniciosa

  21. Comparação através do Blast com o banco de dados de ESTs de Cacau • Das 866 sequências comparadas com os ESTs de Cacau de Verica et al. 2004: - 116 (13%) apresentaram homologia - 750 (87%) não • Das 866 sequências comparadas com os ESTs de Cacau de Jones et al. 2002: - 148 (17%) apresentaram homologia - 718 (83%) não

  22. Comparação entre “nr”, Verica e Jones • De 314 sequências “no hits”, sem homologia no banco de dados de proteínas não redundantes “nr”, 41 (13%) apresentaram homologia com os ESTs de Verica e/ou Jones Jones Verica 4 24 25 41 21 20 314 No Hits “nr”

  23. De 552 sequências com homologia no banco de dados “nr”, 223 (40%) também tiveram homologia com os ESTs de Verica e/ou Jones Jones Verica 32 160 127 223 95 128 552 Hits “nr”

  24. Anotação Blast-X • Foram encontradas homologias com as seguintes classes de proteínas, entre outras: • Pathogenesis-related proteins – proteínas de plantas que são induzidas em situações patológicas ou relacionadas, • Algumas possuem propriedades antifúngicas

  25. Enzimas da via metabólica Fenilpropanóide

  26. Estresse oxidativo: resposta de defesa da planta após o reconhecimento do patógeno, conduzindo a reação de hipersensibilidade • Esta resposta é devido à geração de espécies ativas de oxigênio (ROS), tal como H2O2, O2-, e OH- • Peróxido de hidrogênio pode ser diretamente tóxico ao patógeno e está envolvido com o fortalecimento da parede celular, uma vez que é necessário para a biossíntese de lignina • Fonte: Resende et al., 2003 (Fitopatol. Bras.,v.28, n.2)

  27. Outras proteínas importantes

  28. Divulgação • Zaidan*, H. A., Gramacho, K. P., Silva, S. M., Damaceno, V. O., Rios, V. P., Cruz*, A. P. & Reis, J. Avaliação de métodos de inoculação de Crinipellis perniciosa em frutos de cacau1 (Projeto1 e Bolsas* Financiados pela Fapesb - Convênio 76/2002-Prodoc) XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília-DF, 1-5 agosto, 2005.

  29. Zaidan*, H. A., Gesteira*, A. S., Ceita, G. O., Cascardo, J. M., Carels, N., Costa*, E. A., Lima*, L. S., Serra*, W. O., Braz*, N. R. & Gramacho, K. P. Caracterização molecular da resistência do cacaueiro (Theobroma cacao L.) à vassoura-de-bruxa1 (Projeto1 e Bolsas* Financiados pela FAPESB - Convênio 76/2002-Prodoc) XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília-DF, 1-5 agosto, 2005.

  30. Zaidan*, H. A.; Gesteira*, A. S.; Ceita, G. O.; Carels, N.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J. C. M.; Costa*, E. A.; Lima*, L. S.; Serra*, W. O.; Braz, N. G. R.; Gramacho, K. P. Biblioteca de interação Crinipellis perniciosa X frutos de cacau 1 (Projeto1 e Bolsas* financiados pela FAPESB, Convênio 76/2002-Prodoc). Workshop da Vassoura de Bruxa, UESC, Ilhéus-Ba, 30 novembro a 02 dezembro, 2005.

  31. Zaidan,H.A.*; Gramacho, K.P.; Gesteira, A.S.*; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa, E.A.*; Lima, L.S.*; Serra, W.O.*; Braz, N.G.R.* Molecular analysis of the interaction between cocoa pods and Crinipellis perniciosa1 (1Project and *Fellowship supported by FAPESB, Agreement 76/2002-Prodoc). 15TH INTERNATIONAL COCOA RESEARCH CONFERENCE, San José, Costa Rica, 09-14 Outubro, 2006. (Submetido)

  32. Zaidan*,H.A.; Gramacho, K.P.; Gesteira*, A.S.; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa*, E.A.; Lima*, L.S.; Serra*, W.O.; Braz*, N.G.R. Análise molecular da interação entre frutos de cacau e Crinipellis perniciosa. (Projeto1 e Bolsas* financiados pela FAPESB, Convênio 76/2002-Prodoc). XXXIX Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Salvador-Ba, 14-18 agosto, 2006. (Submetido)

  33. Zaidan,H.A*.; Gramacho, K.P.; Gesteira, A.S*.; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa, E.A.*; Lima, L.S.; Serra, W.O.*; Braz, N.G.R.* Molecular analysis of the interaction between cocoa pods and Crinipellis perniciosa1 (1Project and *Fellowship supported by FAPESB, Agreement 76/2002-Prodoc). Artigo científico em fase de elaboração para ser enviado para publicação em Periódico Internacional Qualis A

  34. Impactos • Este foi o primeiro trabalho a identificar possíveis genes de resistência à vassoura de bruxa em casca de frutos de cacau, o que vem gerando novos conhecimentos, publicações e mais trabalhos na mesma linha de pesquisa • Foram treinados alunos de iniciação científica e técnicos, bolsistas da Fapesb, que hoje continuam a trabalhar na área de pesquisa

  35. Como continuidade dos objetivos deste projeto, podemos citar a Dissertação de Mestrado de Lívia Santos Lima (ex-técnica projeto Prodoc), iniciada em 2005, que está em andamento na UESC: • Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau-crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. (Mestrado em Genética e Biologia Molecular da UESC). Co-orientada por Karina Gramacho, Orientada por Profa. Fabienne Micheli.

  36. Aplicação • Os resultados deste projeto estão permitindo um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na interação cacau-crinipellis • O que está sendo de grande importância para traçar estratégias eficientes para o desenvolvimento de clones de cacaueiro com resistência efetiva e durável à vassoura de bruxa • A partir dos genes seqüenciados, foram construídos 30 primers específicos para os genes de resistência identificados, o que permitirá a caracterização de diferentes acessos de cacaueiro quanto à presença/ausência desses genes (parte da Dissertação Lívia)

  37. Agradecimentos • FAPESB • Bolsistas do projeto • CEPLAC • UESC • FINEP

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