13.2.KROMATOGRAFIJA

1. 13.2.KROMATOGRAFIJA Odjel za kemiju

2. Kromatografiju je izumio ruski botaničar Tswett (Cvet) početkom 20. st. Primijenio je kromatografsku tehniku za odjeljivanje otopine biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu usitnjenim Ca-karbonatom. Odjeljeni sastojci vide se na koloni kao obojene vrpce po kojima je ta tehnika dobila ime (grč. Chroma = boja)

3. 13.2.1. KROMATOGRAFSKE METODE Definicija i osnovni pojmovi Kromatografija je fizikalna metoda koja se koristi za razdvajanje smjesa kojom se sastojci koji se razdvajaju raspodjeljuju između dvije faze: • nepokretne ili stacionarne faze (stationary phase, adsorbent, SP) • pokretne ili mobilne faze (mobile phase, eluent, MP) • Stacionarna faza: kruta, tekuća (vezana na čvrstom nosaču), gel • Mobilna faza • plinovita: plinska kromatografija (gas chromatography, GC), • tekuća: tekućinska kromatografija (liquid chromatography, LC)

4. Kromatografska kolona: cijev koja sadrži stacionarnu fazu i kroz koju prolazi mobilna faza. • Kromatograf: uređaj za izvođenje kromatografskih razdvajanja • Kromatogram: grafički prikaz odziva detektora (kromatografske analize)

5. 13.2.1.1. PODJELA KROMATOGRAFSKIH METODA • Plošna kromatografija • stacionarna faza nanesena je na ravnu plohu ili u pore papira. Mobilna faza prolazi kroz stacionarnu zbog kapilarnih sila ili gravitacije • Kromatografija na stupcu • stacionarna faza ispunjava usku cijev kroz koju se mobilna faza kreće pod utjecajem tlaka ili gravitacije

6. PODJELA PREMA AGREGATNOM STANJU FAZA:

7. PODJELA PREMA FIZIČKO – KEMIJSKIM SVOJSTVIMA ANALITA

8. PODJELA PREMA IZVEDBENIM TEHNIKAMA:

10. 13.2.2. Kromatografska analiza: 1. Unošenje (injektiranje) analita • unošenje uzorka u mobilnu fazu 2. Razdvajanje analita u koloni • sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju različite raspodjele između dviju faza 3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone • različiti sastojci izlaze iz kolone u različitim vremenima 4. Detekcija • eluirane komponente obično se analiziraju mjerenjem neke od fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija, električna vodljivost …)

11. a) TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA (LC) • Eluacija – ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu dodavanjem novih količina otapala. • Ako je stacionarna faza polarna onda se za mobilnu uzima nepolarna.

13. Raspodjela analita između faza Analit se nalazi u ravnoteži između dvije faze: Amobile ⇋Astationary Konstanta ravnoteže K te reakcije zove se koeficijent raspodjele: • cS … molarna analitička koncentracija sastojka u stacionarnoj fazi, • cM … molarna analitička koncentracija sastojka u mobilnoj fazi.

14. Vrijeme zadržavanja(retention time) tR - vrijeme potrebno da analit nakon unošenja uzorka stigne u detektor Mrtvo vrijemetM - vrijeme potrebno da mobilna faza prođe kroz kolonu

15. ..... Faktor kapaciteta (faktor zadržavanja) (retention factor, capacity factor) • za k'A znatno manje od 1  eluiranje je prebrzo, tR teško mjerljivo, • za k'A > 20-30 eluiranje je predugo, • k'A 1 – 5  idealno

16. b) KOLONSKA KROMATOGRAFIJA (CC) Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952. a) punjene kolone • materijal: čelik, staklo, teflon • duljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mm • punjenje: čvrsti nosač (obično dijatomejska zemlja) na kojem je nanesen tanki sloj stacionarne (tekuće) faze b)kapilarne kolone • materijal: danas uglavnom kvarcno staklo • duljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mm • punjenje: unutarnje stjenke prevučene samo slojem tekuće stacionarne faze ili nosačem na kojem se nalazi adsorbirana stacionarna faza

18. c) KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)

19. Primjena PC: • identifikacija supstancija, • ispitivanje čistoće supstancija. • Osobine PC: • relativno brza metoda, • potrebna mala količina materijala. • stacionarna faza: visokokvalitetni filter papir • mobilna faza: otopina razvijača http://www.youtube.com/watch?v=EUn2skAAjHk

23. d) TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC) E. Stahl - začetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950 Isti je pricip kao kod papirne kromatografije.

28. Tankoslojna kromatografija (Thin layer chromatography (TLC))

30. e) PLINSKA KROMATOGRAFIJA (GC) Martin i James – začetnici plinske kromatografije (GC), 1952. (Nobelova nagrada) • Mobilna faza: - inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni napunjenoj stacionarnom fazom. - Za razliku od tekućinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit ne reagira s mobilnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja kroz kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi mobilne faze. • Stacionarna faza: - za odjeljivanje komponenti male molekulske mase: stacionarna faza je čvrsta tvar velike specifične površine na koju se adsorbiraju analizirane komponente, - za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase: stacionarna faza je tekuća faza nanesena na površinu čvrstog nosača adsorpcijom ili kemijskim vezanjem.

31. Analit: • ubrizgava se kao tekućina koja zbog visoke temperature u kromatografu prelazi u plinovito stanje, • temperatura ulaza instrumenta postavlja se na 50°C višu temperaturu od temperature vrelišta najslabije hlapljive komponente iz analizirane smjese.

32. Plinski kromatograf Sastavni dijelovi aparata: • Plin nosilac (carrier gas): • kemijski inertan (N2 He, Ar, H2) • regulirani protok plina • Sustav za unošenje uzorka: • količina uzorka: 0.1 – 20 μL • mjesto unošenja uzorka je grijano (ca. 50°C iznad temp. vrelišta najmanje hlapljivog sastojka

33. Faze plinsko-kromatografske analize: • unošenje uzorka na vrh kolone, • transport uzorka mobilnom fazom kroz kolonu, • adsorpcija sastojaka u stacionarnoj fazi, • detekcija sastojaka. • http://www.wooster.edu/chemistry/analytical/gc/default.html

34. ECD FID

37. Plinska kromatografija

39. Slika prikazuje sofisticirani plinski kromatografski sustav, koji bilježi koncentraciju akrilonitrila u zraku.

40. f) TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPLC)

41. Mobilna faza: tekućina Stacionarna faza: punila vrlo finih zrna Tlak: nekoliko milijuna Pa (do 4 x 107 Pa = 400 bara) - tlačna pumpa, sisaljka Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography): (1) Razdjelna kromatografija (2) Adsorpcijska kromatografija (3) Ionsko-izmjenjivačka kromatografija (4) Kromatografija isključenjem na osnovi veličine čestica (size-exclusion chromatography) Doseg HPLC: najveći u separacijskim tehnikama, proizvodnja > mld USD godišnje

42. Prednosti HPLC: - osjetljivost, - prilagodljivost, - analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva, - široki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline, nukleinske kiseline, šećeri, lijekovi, pesticidi, organometalni spojevi, anorganske tvari i dr.)

44. Shema HPLC uređaja

46. 13.2.3. DETEKTORI Efluent s kolone mješa se s vodikom i zrakom i spaljuje. Organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajući ione i elektrone koji mogu provoditi elektricitet kroz plamen. Na vrh plamenika dovodi se visoki električni potencijal, a iznad plamena postavljena je kolektorska elektroda. Mjeri se električna struja izazvana pirolizom organskih sastojaka.

47. DETEKTORI • Ključni su dio HPLC-uređaja: stalno se usavršavaju • Nema opće primjenljivih detektora (kao FID/TCD) • Zahtjevi: kao kod GC; dodatno: što manji volumen uzorka • Tipovi: (1) prate promjenu svojstava mobilne faze (indeks loma, dielektrična konstanta i dr.), (2) detektori analita (UV, fluorescencija...). • Zastupljenost: 71% UV, 15% fluorescencijski, 5% indeks loma

48. 13.2.3.1. UV/VIS-apsorpcijski detektori • Svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost - vrlo su rašireni • Načelo: apsorpcija elektromagnetskog zračenja u UV-(170 - 400 nm) i VIS-području (400 - 750 nm) • Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu): A = Ɛ × b × c • Tipični UV/VIS-detektor: volumen 1-10 μl, duljina 2-10 mm, tlak < 40 bar (potrebni reduktori)

49. 13.2.3.2. Detektori s filterima - Izvor zračenja: Hg-lučnica iz koje filtar izdvaja λ = 254 nm (odnosno 250, 313, 334 nm) - primjena ograničena. • Izvor zračenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s više filtera (rotirajući) - za serijske analize uzoraka poznata sastava. 13.2.3.3. Detektori s monokromatorima - Prizme ili optičke rešetke (grating) razdvajaju polikromatsko svjetlo na komponente određenih valnih duljina koje se potom djelovanjem pukotine odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram.

50. Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR) odabire se najpogodnija λ, uz moguću kompjutorsku podršku - izvor D2-lučnica (190-800 nm), uz izdvajanje putem rešetke (grating) snopova širokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm) 13.2.3.4. Detektor s nizom dioda (Diode Array Detector) Načelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (“bijelim”) D2-lučnice, a potom disperzija optičkom rešetkom na snopove 2 nm koji istodobno padaju na niz od cca 316 dioda - Cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odličnu reproducibilnost. Dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente.