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Desarrollo y optimización de un sensor óptico para cuantificación y control de calidad de soluciones de anticuerpos monoclonales. Olga Rubio. Sistema Inmune.
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Desarrollo y optimización de un sensor óptico para cuantificación y control de calidad de soluciones de anticuerpos monoclonales Olga Rubio
Sistema Inmune Sistema inmune:conjunto de elementos especiales de un organismo, que le permite defender su integridad biológica frente a agresiones esencialmente externas (virus, bacterias, hongos, etc.) estímulo antigénico Anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig): proteínas producidas en respuesta a la inmunización del organismo con antígenos (Ag) Cada Ac reacciona específicamente contra el mismo antígeno que indujo su formación.
Los Ag son estructuras complejas cuyas superficies tienen diversos sitios que reconocen cada uno un Ac específico. Estas zonas se llaman epitopes o determinantes antigénicos pudiendo cada una, unirse a un Ac diferente. Los Ac se unen a los Ag por sitios llamados paratopes En los mamíferos se distinguen 5 Ac: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE que difieren en tamaño y propiedades. Antígenos (Ag) y Anticuerpos (Ac)
Estructura del anticuerpo Las cadenas se unen por puentes disulfuro. Las cuatro poseen una parte constante y una variable. Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez regiones en las que se concentra la variabilidad: tres segmentos que forman las llamadas regiones hipervariables o CDR
Anticuerpos monoclonales (AcMo) • Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir anticuerpos frente a un antígeno, se produce gran variedad de inmunoglobulinas (Ac policlonales) que poseen función de Ac frente a diferentes epitopes del antígeno. • Los anticuerpos monoclonales son reactivos biológicos homogéneos en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales (policlonales) que son una mezcla variable de inmunoglobulinas.
Uso de los AcMo • Caracterización y cuantificación de sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas (hormonas, interferones, etc.) • Identificación de antígenos presentes en las membranas celulares. • En los trasplantes de órganos: los AcMo dirigidos contra los linfocitos T, se utilizan en casos de amenaza de rechazo agudo. • En Oncología para la localización de células tumorales y/o su destrucción. • En la detección de grupos sanguíneos y estudios de fenotipo.
Interacción Ag-Ac Los Ac se unen por enlaces no covalentes a losepitopes de los Ag en sus sitios activos también llamados paratopes. La zona por donde se unen Ag y Ac se encuentra a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios de la molécula de Ac. (Zona Bisagra)
Características de la unión Ag-Ac Especificidad de la unión Ag-Ac:un Ac se une fundamentalmente a un Ag determinado. Afinidad: Interacción físico-química precisa entre el sitio de combinación de un Ac y un Ag. Se expresa a través de la constante de asociación. ka y kd son las velocidades de asociación y disociación. Avidez: fuerza total que considera todas las interacciones epitope/paratope que tienen lugar entre un Ag complejo y Ac multivalentes.
Adsorción de biomoléculas en solución a superficies sólidas • Es la fijación a la superficie de un sólido, de moléculas, átomos, o iones (adsorbato), por ejemplo los que se encuentran en una solución puesta en contacto directo con esa superficie. El proceso inverso se llama desorción. • Es resultado de la atracción entre las moléculas de la superficie del sólido adsorbente y el adsorbato.
Quimisorción o Adsorción química Moléculas adsorbidas a la superficie como resultado de la formación de un enlace químico (muy fuerte comparado con las fuerzas de ligadura en la fisisorción) Tiempo de adsorción de s a hs Fisisorción o Adsorción física Interacciones débiles: Van Der Waals, de atracción electrostática o atracciones dipolares entre sitios de la superficie y moléculas adsorbidas. Barreras del orden 0.3 a 1 kcal/mol. Tiempo de adsorción de ms a ms Quimisorción y Fisisorción Experimentalmente se encuentran dos órdenes de magnitud diferentes para la atracción que produce la adsorción, indicando dos formas en que las moléculas se pegan a las superficies
Modelo de adsorción deLangmuir • Todos los sitios de la superficie son independientes, equivalentes, distinguibles y de las dimensiones laterales de las macromoléculas adsorbidas y aisladas, • las moléculas adsorbidas (adsorbato), sólo interaccionan con la superficie, • las interacciones entre moléculas adsorbidas son despreciables por ser de corto alcance, • el adsorbato forma una capa monomolecular sobre la superficie, • las macromoléculas adsorbidas no se desplazan sobre la superficie.
ka A + S AS kd Representación simbólica del proceso de adsorción Donde: A indica una molécula de adsorbato, S indica un sitio de la superficie adsorbente, AS esel complejo adsorbato-superficie, ka es la velocidad de adsorción y kd es la velocidad de desorción.
Factor de Recubrimiento Fracción ocupada del total de sitios donde: Nes la cantidad total de sitios de adsorción X cantidad de sitios ocupados por moléculas adsorbidas
La velocidad de adsorción de las moléculas a la interface es proporcional a la concentración de adsorbato en la solución, y a la fracción de sitios vacantes de la superficie : La velocidad de desorción, es proporcional a la fracción de sitios ocupados de la superficie: Variación del recubrimiento La adsorción y desorción sobre el sustrato, ocurren simultáneamente en distintos puntos del mismo
Cinética de Langmuir • Si se expresa Ca como (x,t), donde: • x : es la distancia a la superficie • t : es el tiempo de exposición de la solución a la superficie, las dos variaciones vistas se resumen en una : Aquí el primer término representa la contribución al recubrimiento de la adsorción y el segundo de la desorción
Fenómenos coexistentes en la interacción de solución y superficie • La adsorción de moléculas a la superficie se realiza en • a = (.. ka )-1 • La desorción, tiene un tiempo característico • d = kd-1 • La difusión generada por el gradiente de ., se realiza con el tiempo característico • D = L2/D Donde L es la dimensión característica de la molécula y D es su coeficiente de difusión. Según los tiempos característicos de cada fenómeno el proceso resultante tiene los siguientes casos límite:
Límite de difusión rápida D << a La deposición del Ac sobre la oblea, genera un gradiente en la concentración, que produce difusión hacia la interface, manteniéndose la concentración en la superficie (0,t) en el valor promedio resultando: donde:
Límite D >> a Velocidad de adsorción controlada por la difusión En este caso, la adsorción domina frente a la difusión, siendo prácticamente inmediata la deposición total del Ac, y resultando el recubrimiento, dependiente del coeficiente de difusión de la macromolécula D: (t) (D t)½ Para proteínas en solución, el tiempo de difusión característico, varía en forma típica entre 0,1 y 100 s.
Biosensores Poder de reconocimiento de los sistemas biológicos Selectividad Sensibilidad Diseño instrumental muy simple
Elemento de reconocimiento molecular del analito Elemento Generador de la señal Transductor Componente Biológica Elemento clave Integración del biosistema con el transductor Elementos de un biosensor
Clasificación considerando la Componente Biológica • Sensores basados en enzimas • Inmunosensores • Sensores de ADN • Sensores basados en receptores • Biosensores de células aisladas • De tejidos animales o plantas
Clasificación considerando el Transductor • Biosensores Potenciométricos (electrodos selectivos de iones o gases, FETs) • Biosensores Amperométricos • Biosensores Conductométricos • Biosensores Ópticos • Biosensores Potenciométricos comandables por luz • Biosensores Térmicos • Biosensores Piezoeléctricos
Los Biosensores Ópticos se basan en la medición de • Absorción de la luz • Emisión de la luz • Light scattering (dispersión de la luz) • Fluorescencia de la luz • Reflectancia
Inmunosensores • Son biosensores que usan Ac como detector. El parámetro que se mide puede ser: electroquímico, óptico, cambios térmicos, de masa, etc. • La interacción del analito con la componente biológica del biosensor es registrada por el detector integrado. • Se basan en reacciones inmunoquímicas, por ejemplo la ligadura del Ag a un Ac específico. • La formación de los complejos Ac-Ag debe detectarse bajo condiciones en que se hayan minimizado las interacciones no específicas.
Reflexión Total Interna - RTI Al incidir una OEM, sobre un material rodeado por otro de menor índice de refracción, a partir de un cierto ángulo de incidencia, llamado ángulo crítico, la luz es totalmente reflejada dentro de ese material, y es "guiada" a través de este medio, sin trasmitirse luz al medio de menor índice de refracción ( fibras ópticas)
Onda evanescente Aunque el haz de luz que se propaga a lo largo de una fibra óptica, queda limitado a la región central de la misma, se genera una onda evanescente que penetra una d en el medio de menor índice de refracción, atenuándose exponencialmente. La adsorción de moléculas que se realiza en este medio cambio local del índice de refracción cambio en las condiciones de reflexión Estas variaciones son usadas como parámetro de medida.
Espectroscopía de onda evanescente • El campo electromagnético evanescente tiene una profundidad de penetración que depende de los índices de refracción de los medios y del ángulo de incidencia de la luz. Para luz visible, es del orden de 50 a 500nm. • Debido a esto, un cambio en el medio de índice de refracción menor, influencia las características de la propagación.
Resonancia plasmónica de superficie SPR Al incidir un haz de luz monocromática polarizada, el campo evanescente penetra la lámina de metal excita ondas electromagnéticas superficiales dentro de la región formada por los electrones de conducción del metal (plasmones) las condiciones para SPR son sensibles a las variaciones de n.
Elipsómetro Utilizado para determinar el cambio del estado de polarización de un haz colimado de luz monocromática polarizada, producido por la reflexión sobre una superficie pulida. Permite registrar las variaciones de la intensidad de luz reflejada por la superficie bajo diferentes ángulos de incidencia, y en diversos estados de polarización.
Reflexión de una OEM • Al incidir una OEM monocromática no polarizada sobre una superficie reflectante, la reflectancia varía según el ángulo de incidencia, observándose un mínimo en un ángulo llamado de incidencia principal (o de Pseudo Brewster para superficies conductoras o semiconductoras). • El campo E de cualquier onda incidente, se puede descomponer en dos componentes: una incluida en el plano de incidencia, o componente de polarización p y otra perpendicular al mismo o componente de polarización s.
Polarización por reflexión bajo ángulo de incidencia principal OEM monocromática no polarizada, que incide bajo el ángulo de incidencia principal; la componente p se trasmite, la componente s en parte se trasmite y en parte se refleja. El rayo reflejado y el trasmitido resultan perpendiculares.
Onda de polarización p queincide bajo ángulo principal • OEM monocromática incidente polarización p bajo el ángulo de incidencia principal • superficies dieléctricas Rmin = 0 • superficies semiconductoras o conductoras Rmin 0 Alteración de las condiciones de la superficie cambio en el índice de refracción de la interface aumento en la intensidad reflejada se puede emplear para detectar la adsorción de moléculas a la superficie.
Aumento de Intensidad del haz láser reflejado Anticuerpo Oblea de Silicio Esquema del inmunosensor óptico por reflectometría láser Haz láser incidente Haz láser reflejado
Plataforma del elipsómetro Tubo Foto multiplicador Láser 633nm Conjunto celda -membrana - oblea PC celda membrana Oblea de Si Montaje Experimental
Reflectancia de onda polarizada p, en incidencia bajo ángulo principal, para diferentes superficies l = 633 nm Semiconductor: Mínimo no nulo Dieléctrico: Mínimo nulo
Detección de biomoléculas por reflectometría • Se basa en la medición de los cambios de reflectancia, desde una superficie puesta en contacto con dicha solución, debidos a la adsorción sobre la superficie, de biomoléculas en solución. • Requisitos de la superficie: • plana y homogénea • índice de refracción muy diferente del de las biomoléculas (para detectar fácilmente los cambios relativos de las intensidades de luz reflejada provocados por la adsorción de dichas biomoléculas).
Mediciones de Intensidad Reflejada Intensidad láser reflejada en función del tiempo y curva correspondiente al ajuste de datos gráfica corresponde al agregado de 80 g de anti-AB monoclonal a la celda
Realizando los reemplazos y P3 = P1 = A P2= (1) se expresa (2) Cinética de adsorción de anticuerpos (1)
Casos límite . Si t 0, (2) resulta . Si t , (2) tiende a Imax, resultando
Ángulo de Incidencia Principal para Interface Aire-Silicio
Ángulo de Incidencia Principal para Interface Si-solución fisiológica
Curva de calibración Valores de f (C) para cada cantidad de anti-AB agregada Constante de adsorción ka = ( 7.2 ± 0.5). 10-5 1/g.s
Determinación de una concentración incógnita Se determinan los parámetros P1, P2 y P3 y f(C) para una muestra incógnita, resultando f(C) = (0.0198 ± 0.0007) 1/s. Por interpolación sobre la curva de calibración se calcula la cantidad de AcMo adsorbido a la oblea: C ± C = (173 ± 9) g Por método Colorimétrico se constata: *que la muestra usada contenía (180 ± 10) g de anti-AB en la celda, valor que cae dentro del entorno determinado. * la ausencia de AcMo en el sobrenadante, lo que indica que el total de proteína había sido adsorbido a la oblea.
Aplicación a la determinación de una concentración incógnita f(C) = (0.0198 ± 0.0007) 1/s C ± C = (173 ± 9) g
Obtención de la constante de desorción • Teniendo en cuenta que Resulta Y en base a los valores promedio de f(C) y de P3 medidos se calcula la constante de desorción de los AcMo empleados: kd = ( 0.09 ± 0.03) 1/s
Discusión y conclusiones • Los valores de f(C) y de P3 son independientes de la intensidad incidente en la interface oblea de Si-solución fisiológica. Por lo tanto, este método resulta independiente de las características de la fuente de iluminación. • Las gráficas obtenidas de I vs t son muy bien aproximadas (R>0,94) con la función de la correspondiente a la cinética de adsorción de acuerdo con el modelo de Langmuir. • El método permite obtener la concentración de anticuerpo en una muestra incógnita • Se pueden obtener las velocidades de adsorción y desorción del Ac a la oblea de Si • No es necesario marcado de la proteína • Se puede usar con mínima cantidad de proteína
