250 likes | 525 Vues
Projectvoorstel: Cytokine productie door probiotica als behandeling voor de ziekte van Crohn. Groepje 1: Coline Gerritsen Eric Lammertsma Frederik Verweij. Inhoud. Inleiding Achtergrond ziekte van Crohn Hoofdvraag Deelvragen Opzet van het onderzoek De experimenten Tijdsplanning
E N D
Projectvoorstel:Cytokine productie door probiotica als behandeling voor de ziekte van Crohn. Groepje 1: Coline Gerritsen Eric Lammertsma Frederik Verweij
Inhoud • Inleiding • Achtergrond ziekte van Crohn • Hoofdvraag • Deelvragen • Opzet van het onderzoek • De experimenten • Tijdsplanning • Relevantie en haalbaarheid
Ziekte van Crohn • Ontstekingen in de digestieve tractus • Veel bewijs voor immunodeficiëntie • Neutrofielen deficiënt in: • Migratie of ‘chemotaxis’ • Superoxide generatie • Fagocytose • ‘Microbial killing’ • Opportunistische of pathogene bacteriën kunnen zich op het epitheel manifesteren
Hoofdvraag Is het mogelijk om gemodificeerde probiotica te maken die door middel van het uitscheiden van cytokinen deficiënte neutrofielen kunnen stimuleren in hun functioneren en hiermee de ziekte van Crohn te kunnen behandelen?
Deelvragen • Welke cytokinen stimuleren neutrofielen? • Is de stimulatie van deficiënte neutrofielen met cytokinen voldoende om hun functie te herstellen? • Kan een probioticum gemodificeerd worden om cytokinen te gaan produceren? • Heeft de toediening van gemodificeerde probiotica die cytokinen produceren tot resultaat dat de mate van ontstekingen bij de ziekte van Crohn vermindert? • Heeft de toediening van gemodificeerde probiotica ook bijwerkingen?
Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen
Experiment 1:Cytokinen en neutrofielen • Fluorescentie bepaling van GFP-producerende bacterien • m.b.v. fluorescentie spectrofotometer • Gebruik maken van: • Deficiënte neutrofielen • Normaal functionerende neutrofielen • Cytokinen • GFP-producerende bacteriën
IL-1 IL-1β IL-6 IL-8(/NAP-1) IL-18 IL-15 NAP-2 NAP-3 NAP-4 PAF IFN-γ TNF-α GM-CSF G-CSF MIP-1 MIP-2 Experiment 1:De cytokines
Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen
Experiment 2:testen van de geschikte cytokinen op muizen • Onderzoeken of: • De ernst van de ontstekingen verminderen • De cytokinen geen schadelijke effecten hebben op de muizen • Gebruik maken van modelmuizen • SAMP1/Yit muizen: spontane gastrointestinale inflammatie • Controleren op: • Algemene gezondheidstoestand • Ernst van de ontsteking
Experiment 2:testen van de geschikte cytokinen op muizen • Uitvoering: • Modelmuizen cytokinen toedienen, in een vloeibare oplossing • Verschillende concentraties cytokinen • Modelmuizen vloeibare oplossing toedienen zonder cytokinen (ter controle) Alle groepen bestaan uit 5 muizen. Dagelijkse toediening gedurende 1 maand
Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen
Experiment 3:Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Genetische modificatie Lactococcus Lactis • Veilige bacterie • Eerder succesvol gemodificeerd • Methode volgens Lothar Steidler et al • Productie van een cytokine expressievector • Koppeling van geproduceerde cytokine aan bacteriële secretie signaalpeptide • Controle op cytokineproductie m.b.v. Western Blot
Experiment 3:Genetische modificatie - Methode volgens Lothar Steidler et al • Expressieplasmide productie door E. Coli • kortstondige oligonucleotide-gemedieerde mutagenese • Vormt pLET2 secretievector • Bevat secretie signaalpeptide (L2) • T7 RNA polymerase promotie (P) • T7 terminator (T)
Experiment 3:Genetische modificatie - Methode volgens Lothar Steidler et al • Plaatsing van restrictiesite (Nae I) • Tussen secretie-gen en terminator • Aanpassing van twee codons
Experiment 3:Genetische modificatie - Methode volgens Lothar Steidler et al • Verwijdering van humaan secretiesignaal sequentie uit cytokine-gen (L) • Inbrengen van cytokinegen op NaeI-restrictiesite • Resultaat: T7 RNA polymerase gemedieerde productie van cytokine met bacteriële secretie signaalpeptide • Testen m.b.v. Western Blot
Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen
Experiment 4: testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Onderzoeken of: • De ernst van de ontstekingen verminderen • De cytokine producerende probioticum geen schadelijke effecten hebben op de muizen • Gebruik maken van modelmuizen • SAMP1/Yit muizen: spontane gastrointestinale inflammatie • Controleren op: • Algemene gezondheidstoestand • Ernst van de ontsteking
Experiment 4: testen van een cytokine producerend probioticum op muizen wordt • Uitvoering: • Modelmuizen gemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Verschillende concentraties probiotica • Modelmuizen ongemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Modelmuizen met ziekte van Crohn vloeibare oplossing toedienen zonder probiotica (ter controle) • muizen van het vorige experiment kunnen gebruikt worden. Alle groepen bestaan uit 5 muizen. 1 maand dagelijkse toediening
Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen
Experiment 5: testen van een cytokine producerend probioticum op mensen • Onderzoeken of: • De ernst van de ontstekingen verminderen • Het cytokine producerende probioticum geen schadelijke effecten heeft op mensen • Controleren op: • Algemene gezondheidstoestand • Ernst van de ontsteking d.m.v colonoscopie
Experiment 5: testen van een cytokine producerend probioticum op mensen • Opzet van het experiment: • Patiënten met de ziekte van Crohn gemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Patienten met de ziekte van Crohn ongemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Patienten met de ziekte van Crohn vloeibare oplossing toedienen zonder probiotica (placebo, ter controle) Alle groepen bestaan uit 50 patiënten. Gedurende 6 maanden dagelijkse toediening probiotica
Relevantie en haalbaarheid • Ziekte van Crohn: • Incidentie: 5-10 per 100.000 per jaar • Prevalentie: 50-100 per 100.000 • Chronische aandoening • Eerdere onderzoeken: • Gemodificeerde bacteriën die cytokinen produceren (IL-2, IL-6, IL-10) • Veelbelovende resultaten met gemodificeerde bacterien die IL-10 produceren m.b.t. IBD