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TECHNIQUES

TECHNIQUES. Principes et applications. Culture de Tetrahymena Données de base. Température optimale: 28 °C Température minimale: environ 12-14 °C Température maximale: environ 31-32 °C (choc thermique réversible) Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h).

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Presentation Transcript

  1. TECHNIQUES Principes et applications

  2. Culture de TetrahymenaDonnées de base • Température optimale: 28 °C • Température minimale: environ 12-14 °C • Température maximale: environ 31-32 °C (choc thermique réversible) • Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h)

  3. Culture de TetrahymenaMilieux de culture • Culture axénique: sans autres micro-organismes • Milieu semi-défini • Source acides aminés: hydrolysat de protéine • Protéose, peptone, tryptone, lait • Source de vitamines: extrait de levure • Glucose • Sels: peu concentrés, maintien du pH • Na ou K, H2PO32-

  4. Culture de TetrahymenaCulture stock • Température basse: 14°C • Milieu pauvre • Pas de source de vitamines ou glucose • Peptone peu concentrée => Doit utiliser beaucoup d’énergie/temps pour synthétiser vitamines et autres • Croissance lente • Repiquage moins fréquent

  5. Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement • Température presque optimale: 25°C • Milieu riche • source de vitamines ou glucose • hydrolysats plus concentrées et variés • Réadaptation progressive à des conditions de croissance rapide

  6. Culture de TetrahymenaCulture de croissance • Température optimale: 28°C • Milieu riche • source de vitamines ou glucose • hydrolysats plus concentrées et variés • Agitation: meilleure oxygénation • Conditions de croissance rapide • Obtention de grandes quantités de cellules

  7. Culture de TetrahymenaCulture massive • Température optimale: 28°C • Milieu très riche • source de vitamines et glucose • lait comme source d'acides aminés • Agitation: meilleure oxygénation • Conditions de croissance rapide • Obtention de très grandes quantités de cellules

  8. Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini • Milieu défini: [ ] exactes de toutes les composantes individuelles sont connues • Température optimale: 28°C • Milieu • Acides aminés • Vitamines • Glucose • Autres éléments (ac. gras, minéraux….) • => Connaissance et contrôle des conditions

  9. Culture de TetrahymenaMilieu minimal • Tris 10 mM + pH 7.6 + Glucose • Milieu simple pour incorporation acides aminés marqués • Pas de croissance • Court terme • "choc" => induisant une réponse ????

  10. TetrahymenaConcentration des cellules • Dispositif de concentration • Certaines manipulations requièrent des concentrations de cellules non obtenues par des cultures de croissance • Si on a besoin de concentrer les cellules

  11. TetrahymenaConcentration des cellules Lang et Gauthier (1993)

  12. TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre Détermination du nombre de cellules Hémacymètre Normalement destiné à l'énumération des cellules du sang 2 cotés et 5 zones par coté 10 zones = 1 µL Lamelle spéciale (coûteuse) Cellules immobilisées (formaldéhyde) Cellules cotés: supérieurs et gauches

  13. http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtools/hemarefpf.htmlhttp://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtools/hemarefpf.html

  14. TetrahymenaTraitements • Exposition à choc thermique ou toxique • Cellules concentrées/diluées pour obtenir conc. finale voulue • Tubes contenant le milieu de culture (selon volume final voulu) • toxique concentré --> conc. finale voulue au temps = 0 • cellules concentrées --> conc. finale voulue • N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube • 1 tube sans produit toxique: solvant du toxique

  15. Traitements • Incuber à T° voulue • Prélever aliquotes aux temps voulus --> µtubes (1.5 ou 2 mL) • Centrifuger > 10 kRPM x 10 min --> sédiment = cell. • Extraire les cell. en resuspendant dans soln voulue • SDS --> électro.

  16. Electrophorèse (EGPA) • Séparation des protéines par EGPA-SDS • Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage • Charge uniforme + géométrie similaire • séparation selon masse • Système triphasique • Tampon d'électrode: glycine • Gel de tassement: Cl- pH 6.8 (conc. PA faible) • Gel de séparation: Cl- pH8.8 (conc. PA forte) ==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour donner une résolution supérieure

  17. ElectrophoresePrincipe de la séparation

  18. ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées • Electrophorèse • Tassement • Séparation • Fixation et Coloration • Ac. Acétique 10% • Bleu de Comassie (simple et sensible) • Argent (complexe mais très sensible) • Buvardage ou Séchage + conservation

  19. Buvardageprincipes • Transférer à la surface d'une matrice solide • Différentes matrices: nitrocellulose… PVDF, nylon. • Capacité d'adsorption • Buvardage: transfert électrophorétique • Adsorption: forces hydrophobes, ioniques • Méthanol. porosité de la matrice, durée et puissance du transfert

  20. Transfert westernmécanisme

  21. Immunodétection • Identification et détection d'une protéine spécifique • Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt • Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice • Buvardage électrophorétique • Application directe ("dot blot")

  22. Immunodétectionprécautions • Blocage des sites inoccupés • Protéines: lait en poudre, albumine, collagene (gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps, enzyme indicateur • Prévention des liaisons non spécifiques • détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et Ab-marice non spécifique)

  23. Immunodétection • Adsorption de l'anticorps sur l'antigène (primaire) • Adsorption de l'anticorps secondaire conjugué avec enzyme sur l'antigène primaire (autres marqueurs fluorochromes) • Détection de l'enzyme: Chromogénique Chemiluminescent Radioactif, fluorescent, etc.

  24. Immunodétection: enzymes • Phosphatase alcaline • Sensible • Bon contraste en photo • Stable • Peroxydase de raifort (HRP) • Assez sensible • Durée limitée incubation (H2O2) • Coloration +/- stable (H2O2) • Contraste moyen

  25. Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration • Déposer même quantité de protéines ou protéines provenant d'une même quantité de cellules = difficile • Base de comparaison: étalon interne • Protéine qui reste en quantité stable dans une cellule • Étalons courants: actine, GAP

  26. Immunodétection

  27. Marquage métabolique des protéines • Souvent on doit être capable de distinguer les protéines dont la synthèse est induite/ralentie par le traitement • => Marquage métabolique: • Exposition des cellules a des ac. Aminés marqués • Extraction et séparation des protéines • Autoradio- ou fluorographie

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