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PLAN. I. Support et organisation de l'IG II. Mécanismes moléculaires de conservation de l'IG III. Mécanismes moléculaires de l'expression de l'IG IV. Transmission de l'IG lors de la mitose . A. Support moléculaire de l'IG B. Organisation fonctionnelle des génomes

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Presentation Transcript

  1. PLAN I. Support et organisation de l'IG II. Mécanismes moléculaires de conservation de l'IG III. Mécanismes moléculaires de l'expression de l'IG IV. Transmission de l'IG lors de la mitose

  2. A. Support moléculaire de l'IG B. Organisation fonctionnelle des génomes C. Support cellulaire de l'IG I.Support et organisation de l'IG

  3. A. Support moléculaire de l'IG : les acides nucléiques B. Organisation fonctionnelle des génomes 1- Le génome bactérien : circulaire

  4. 1- Le génome bactérien : circulaire a) Condensation dans le nucéloïde - Taille 4.2 106 pb - Double hélice (double brin) - Par superenroulement (topoisomérase ajoute ou défait les vrillages : <0 naturellement; >0 artificiciellement ou temporaire) -  2 à 4 copies du chromoïde (dans cellule en croissance) - Associé à protéines (différentes des histones eucaryotes)

  5. a) Condensation dans le nucléoïde b) Cartographie du génome  Mesure des cinétiques de réassociation de l'ADN

  6. Cinétique de réassociation de l'ADN dC/dt = -kC2 C : concentration des séquences simple brin au temps t k : constante d'association Noter le 0 de l'axe des ordonées et la représentation logarithmique de l'axe des abscisses

  7.  Toutes les séquences chez E. coli sont uniques (4,2.106 bp) 900 gènes dont 7 codant pour ARNr et prot ribosomiales (proche oriC).

  8. les gènes bactériens peuvent être polycistroniques : ex opéron lactose

  9. - Cas des Plasmides ( 50/cell) codent pour gènes qui confèrent proprio particulières Ex : conjugaison ; émission de pili sexuels ; résistance aux antibiotiques etc. Mésosome

  10. a) Condensation dans le nucéloïde b) Cartographie du génome c) Fluidité du génome : les gènes sauteurs - 1940 Mee sur Maïs (couche à aleurone bigarrée) par Barbara Mac Clintock

  11. c) Fluidité du génome : les gènes sauteurs - mécanisme : IR inversée répétés encadrant séquence codant pour une transposase (ne s'exprime qu'une fois et déclenche insertion sur zone cible de la copie, le transposon mère reste à sa place

  12. c) Fluidité du génome : les gènes sauteurs -  transposons plus complexes Ex : Tn1688 avec deux transposons simples encadrant le gène de la toxine thermostable d'E.coli. - Conséquence : mutations, inactivation ou réactivation de gènes (cancerigenèse)

  13. B. Organisation fonctionnelle des génomes 1- Le génome bactérien : circulaire 2- Le génome extranucléaire : mitochondrial et chloroplastique a) Des molécules circulaires c1) Cas des chloroplastes 154000nt 2 séquences répétées et inversées (25000 pb) encadrent une séquence unique courte (Short Single Copy, 18000 pb) et une séquence unique longue (Long Single Copy, 86000 pb) c2) Cas des mitochondries - 84000 pb chez levures - 16500 pb chez humains - Introns chez levures (ex. cytochrome b = 6 cytochrome oxydase = 7 Pas chez humains

  14. 5 mm et 16569pb chez l'Homme (mais 84 000 chez levure! ) 107 daltons (très petit par rapport aux 3.109 pb nucléaire) 300 et 500 mitochondries / cell. environ 100 molécules d’ADN mt / mito.

  15. a) Des molécules circulaires b) Coopération génome nucléaire / extranucléaire c2) Cas des mitochondries ex de l'ATPsynthétase des mitochondries (et chloroplastes) - dans Fo : I et III chloroplastiques; II cytoplasmique - dans F1 : a, b, e chloroplastiques; g, d cytoplasmiques c1) Cas des chloroplastes - ex des photosystèmes - antenne collectrice : cytoplasmique - PSI et PSII : chloroplastiques

  16. 1- Le génome bactérien circulaire 2- Le génome extranucléaire 3- L'ADN génomique des Eucaryotes : linéaire, surenroulé en chromosome a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées

  17. - Interprétation - Chez Procaryotes et génome extranucléaire, tout l'ADN est fonctionnel (temps proportionnel à complexité et nb de pb) - Chez Eucaryotes il existe une grande partie du génome non transcrit  rôle?

  18. Séquences fortement répétées - Très petites taille (= 60 pb) - Fonction? - 2 Types : - séquences dispersées (régulateurs de transcription?) - séquences regroupées :

  19. ADN satellite : - disposition distinguable en gradient de ClCs - Séquences riches en A (GAAAAA...) Séquences télomériques : - Dans régions terminales de l'ADN - (TTTGGG)n fois  hétérochromatine : (10% du l'ADN) toujours condensée, même pendant interphase; séquences constitutives des - centromères, - centre organisateurs nucléolaires

  20. Séquences moyennement répétées  Séquences à fonction inconnue : - SINE = Short INterspersed Éléments de 200 à 300 pb - LINE = Long INterspersed Éléments de 5000 à 6000 pb:

  21. Séquences moyennement répétées  Séquences à fonction connue : - code pour produits de la transcription : ARN ribosomiaux ou de transfert - code pour protéines histones

  22. Séquences très répétées Séquences moyennement répétées Séquences uniques  Familles multigéniques : gènes différents mais qui donnent des polypeptides très proches (qui exercent fonction voisines au cours de la vie cellulaire mais pas au même moment Ex : gènes de globine, d'actine (10 à 20 gènes), de myosine, de tubuline, de kératine  Théorie brownienne ("aléatoire" ou "statistique") de génétique : un gène a d'autant plus de chance d'être transcrit qu'il est proche d'une gène transcrit

  23. Moins de 100kb

  24. Plus de 100kb

  25. a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées b) Un génome morcelé - Mise en évidence d'une maturation des ARNm chez les eucaryotes exp. ARNm d'ovalbumine chez cellules oviducte de poule cf epissage des introns au niveau des pores nucléaires  épissage alternatif. Notion de transcriptome : démultiplication des transcrits (par épissage alternatif) 100 000 transcrits différents pour 25000 gènes (pas tous exprimés dans un type cellulaire donné)

  26. Modélisation de l'intervention des SNURP U1 à U6 dans l'épissage des introns

  27. - Notion de génome (à distinguer d'ADN nucléaire) : ensemble des gènes. Rappels : - ADN satellite = hétérochromatine : 10% de l'ADN nucléaire; - ADN répété dispersé : 20% de l'ADN nucléaire - ADN parfois considéré comme "poubelle" : plus de 50% de l'ADN nucléaire mais jouant le rôle d'espaceurs (vision statistique du transcriptome) - ADN transcrit en ARNprém = génome (25 000 gènes chez l'Homme) : 5 à 7 % de l'ADN nucléaire  Environ 40% seulement des gènes du génome sont transcrits dans un type cellulaire soit 2 à 3% de l'ADN nucléaire

  28. a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées b) Un génome morcelé c) De l'ADN associé à des protéines : la chromatine Définition simplifiée de la chromatine - Forme sous laquelle l'ADN nucléaire est associé aux protéines histones. NB : ADN absolument nu n'existe pas, ni chez les Procaryotes (pseudohistones et/ou autres protéines acides) ni chez les Eucaryotes, ni chez les acaryotes (Virus : prot SSB sur ADN simple brin, par ex.).

  29. Caractérisation de la chromatine • Méthode d'étude de la chromatine • - Caractérisation difficile de l'état natif de la chromatine : • isoler + purifier • - Chromatine insoluble dans les tampons physiologiques • - Quand [sels]  : dissociation des protéines dénude l'ADN  visqueux (brin long) • - Nécessité de couper physiquement l'ADN : ultrasonication • (on ne sait pas trop ce qu'on a perdu…)

  30. Composition de la chromatine • ADN purifié = 30% (en masse) • Protéines histones : 40 % • Type PM ( D) Nb d'aa Rapport Lys/Arg • H1 23 000 216 aa 10 : prot très basique • H2a 14 000 129 aa 1,2 • H2b 13 700 105 aa 2,5 • H3 15 300 135 aa 0,7 • H4 11 000 102 aa 0,8 •  Toutes sont basiques • Pas spécifiques de l'espèce (2 aa différents entre pois et souris)

  31. Protéines non histones : 25 % • - Toutes sont neutres ou acides • - 300 types différents • - Imparfaitement connues • - Rôles (?) : • structural (charpente, centre organisateur du nucléole, des • kinétochores, du centrosome , des extrémités • télomériques…)? • Transcription? • Maturation des ARN?

  32. ARN : 5 % • - rôle fonctionnel • - rôle structural ? • Ex : Implication dans la formation de HC • Cas de l'HC centromérique : caractérisée par forte concentration d'histone H3 méthylée et de protéines HP1 hétérochromatiques de structure • Après incubation avec de la RNAse A  délocalisation des HP1

  33. a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées b) Un génome morcelé c) De l'ADN associé à des protéines : la chromatine d) Les différents états de la chromatine : nucleofilament  condensé - décondensée pendant interphase - condensée pendant mitose : K métaphasique (assure réplication conforme et protection mécanique au cours de la ségrégation des lots de gènes)

  34. Filament de chromatine X 125 000

  35. d1) Structure décondensée de la chromatine : le nucléofilament (fibre nucléosomique) = une molécule d'ADN associée à des protéines histones basiques  Mise en évidence de l'organisation en nucléosomes du nucléofilament Filament de chromatine X 125 000 marqué au tétroxyde d'osmium OsO4

  36. - microscope électroniqueME : chaînes de particules accolées de  11nm (27 à 30 nm fonction de la présence ou non de H1. [NaCl]<0,3M - Spectre de diffraction aux RX : période 100Å (10 nm) (≠ périodicité de l'ADN ou des histones) - Réalité fonctionnelle : toutes les endonucléases (foie de rat, staphylocoque...) coupent le nucléofilament environ toutes les 200 pb (du à propriété du nucléofilament et non des endonucléases) - Étude des associations ADN/histones par pontage chimique

  37. Conséquences physiologiques : lors de la réplication, l'ADN s'ouvre tous les 200pb

  38.  Association des histones Acétylations des histones néosynthétisées H4 sur les lysines K5/K12 Assemblage des histones : par liaisons faibles type Van der Waals tétramère (H3-H4) d'histones nouvellement synthétisées + 2 dimères H2A-H2B  formation de la particule nucléosomale cœur (core particule) Maturation (consomme ATP)  espacement régulier des nucléosomes  désacétylation des histones nouvellement incorporées Incorporation des histones H1 internucléosomales  repliement du nucléofilament

  39. L'ADNase 1 relâche les liens : les noyaux s'éloignent = on obtient un nucléofilament Ici : digestion  poussée à la DNase micrococcale

  40. d2) Hétérochromatine condensée et méthylation de l'ADN  Hétérochromatine constitutive ou facultative

  41. L'HC facultative est réversible : méthylée sur Lysine K9, hypoacétylées, répliquée tardivement, fct du stade de développement ou du type cellulaire. • Ex1 : X inactif (Corps de Barr) dans les cellules somatiques femelles • Ex2 : vésicule sexuelle (VS) inactive au stade pachytène de la méiose masculine (mutation provoque stérilité)

  42. La position de certains gènes à proximités d'HC facultative peu gêner leur transcription (régulation) • L'HC constitutive n'est pas réversible • Ex1 : HC centromérique = assure cohésion des chromatides sœurs et disjonction des chromosomes mitotiques

  43. métyltransférase DNAmétyltransférase Heterochromatine Protein 1

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