ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ – ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

1. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ – ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΛΗ Γ. ΜΑΚΕΔΟΥ Ιατρός Βιοπαθολόγος Διδάκτορας Α.Π.Θ. Επιστημονική Συνεργάτης Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ.

2. ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 1937: Arne Tiselius apparatus (υγρό μέσο) 1950: Ηλεκτροφόρηση ζώνης (στερεό ή gel)

3. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ • Είναι μια μορφή χρωματογραφίας • Βασίζεται στη μετακίνηση φορτισμένων μορίων κάτω από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου. • Οι χημικές ενώσεις που φέρουν φορτίο λόγω ιοντισμού μετακινούνται, ανάλογα με το είδος του φορτίου, προς την άνοδο (θετικό πόλο) ή προς την κάθοδο (αρνητικό πόλο). • Εφαρμόζεται • στο διαχωρισμό μακρομορίων, π.χ. πρωτεϊνών, λιποπρωτεϊνών, DNA και RNA, και οργανικών ουσιών • στον έλεγχο της καθαρότητας δείγματος • ποσοτικό και ποιοτικό έλεγχο • προσδιορισμό ΜΒ

4. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ • Οι πρωτεΐνες έχουν αρνητικό ή θετικό ολικό φορτίο ανάλογα με το pH(αμφολυτικές ιδιότητες). • ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ: pΗστο οποίο το ολικό φορτίο είναι ουδέτερο. • Ο διαχωρισμός πρωτεϊνών γίνεται με την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα.

5. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ U = Ez / f • U = ταχύτητα μετακίνησης μορίου σε ηλεκτρικό πεδίο • Ε = ένταση του ηλεκτρικού πεδίου • z = καθαρό φορτίο του μορίου • f = συντελεστή τριβής (εξαρτάται από μάζα και σχήμα μορίου και από πυκνότητα του μέσου) • Ez = ηλεκτροστατική δύναμη που οδηγεί το μόριο

6. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ μ = Q / k. r. n • Ηλεκτροφορητική κινητικότητα (μ) • Ανάλογη με το φορτίο του μορίου (Q) • Αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθός του (r) και τη γλοιότητα του διαλύματος (n)

8. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΣΥΣΚΕΥΗ

9. ΚΥΡΙΕΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ • Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (zone electrophoresis, ZE) • Ισοταχής ηλετροφόρηση (Isotachophoresis, ITP) • Ισοηλεκτρικός εστιασμός (Isoelectric focusing)

10. Α. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ

12. ΜΕΣΟ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ • Χαρτί(Paper electrophoresis) • Οξική κυτταρίνη(Cellulose acetate electrophoresis) • Τριχοειδής σωλήνας (Capillary electrophoresis) • Πηκτές (gels) – πορώδη υλικά • Αγαρόζης (Agarose electrophoresis) • Πολυακρυλαμίδης (PAGE) • Με αποδιάταξη –απώλεια τεταρτοταγούς δομής (SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate) • Χωρίς αποδιάταξη (native PAGE) • Δύο διαστάσεων (2D-electrophoresis)

13. ΠΗΚΤΕΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ • Εύκολος χειρισμός • Φυσικό και όχι χημικό περιβάλλον για το δείγμα • Εύκολος χειρισμός του δείγματος • Μπορεί να αποθηκευτεί το gel (4οC) • Όσο μεγαλύτερη η πυκνότητα τόσο μικρότερα μακρομόρια διαχωρίζονται (0,6 – 3%) • Συνήθως χρησιμοποιείται 1% ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • Ηλεκτροφόρηση μεγάλων μορίων DNA • Ηλεκτροφόρησηπρωτεϊνών ΜΒ>200kDa,λόγω μη ομοιογενών πόρων

14. ΠΗΚΤΕΣ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΚΑΙ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ (PAGE) • Ομοιόμορφοι πόροι • ΠΡΟΣΟΧΗ Η ακρυλαμίδη είναι νευροτοξίνη ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • ΗλεκτροφόρησηπρωτεϊνώνMB 5-2000kDa για • Διαχωρισμό πρωτεϊνών • Διαχωρισμό ισομορφών πρωτεϊνών • Ηλεκτροφόρησημικρών μορίων DNAή RNA και ολιγονουκλεοτιδίων • Πυκνότητες 6%, 8%, 10%, 12%, 15%

15. ΠΗΚΤΕΣ • Αποδιάταξης (denaturating) • SDS (Sodium dodecyl sulfate): Αποδιατάσσει την πρωτεΐνη • Χωρίς αποδιάταξη (native) • Χρήση στην πρωτεωμική • Μελέτη τεταρτοταγούς δομής πρωτεΐνης • Οπτικοποίηση όχι μόνο με χρώσεις αλλά και με μεθόδους ανοσολογικές

16. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΦΟΡΤΙΣΗΣ(Loading buffers) • Bromophenol blue • Cresol Red • Orange G

17. ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ • Ρόλος: • Μεταφορά ρεύματος • Διατήρηση του pH σταθερού • Είδη: • Βαρβιτουρικά • Tris (τρις υδροξυλαμινομεθάνιο) • Tris/Acetate/EDTA • Tris/Borate/EDTA • pH = 8,8

18. ΟΠΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ • Χρώσεις • Coomassie Brilliant Blue (έως 30 ng) • Colloidal Coomassie Blue (έως 10 ng) • Zinc-imidazole(έως 2 ng) • Silver stain (έως 2 ng) • SYPRO Ruby (έως 1 ng) • Oil Red O • Sudan Black B

19. ΟΠΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ • Πυκνόμετρο σάρωσης (scanning densitometer) – για ποσοστιαία αναλογία κλασμάτων • Ανάγνωση σε UV • Blotting(π.χ. Western) • Ανάλυση με φασματογράφο μάζας

20. ΤΥΠΟΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ

21. 1.ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΧΑΡΤΙ • Στο παρελθόν χρήση για λευκώματα ορού • Πλεονεκτήματα: • Υψηλή αντοχή υλικού • Χαμηλό κόστος • Ευκολία χρήσης • Μειονεκτήματα: • Διάρκεια 14 – 16 ώρες • Χαμηλή διακριτική ικανότητα

22. 2. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΟΞΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ • Αποτελούσε μέθοδο εκλογής για διαχωρισμό πρωτεϊνών • Αντιδρά η κυτταρίνη (-ΟΗ) με οξικό ανυδρίτη • Σε ξηρά μορφή – μεμβράνες εύθρυπτες και λευκές • Προηγείται ενυδάτωση πριν τη χρήση με το ρυθμιστικό διάλυμα • Ακολουθεί • Χρώση • Μονιμοποίηση και έκπλυση με οξικό οξύ 5% • Αφυδάτωση με μεθανόλη • Διαύγαση με μεθανόλη 95% και οξικό οξύ 5%

23. 3. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • ΚΥΡΙΩΣ για το διαχωρισμό DNA και RNA • Καθαρισμό / απομόνωση τμημάτων DNA μετά την επίδραση περιοριστικών ενζύμων • Ανάλυση προϊόντων PCR • Ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό DNA

24. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ DNA ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ

25. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ

26. ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ Χωρίς UV Με UV

27. B. ΙΣΟΤΑΧΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

28. ΙΣΟΤΑΧΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ(Isotachophoresis) • Μετεξέλιξη της ηλετροφόρησης • Διαχωρισμός φορτισμένων σωματιδίων με τη χρήση μη συνεχούς ηλεκτρικού πεδίου. • Το δείγμα εισάγεται ανάμεσα σε • ένα ταχύ ηλεκτρολύτη (χαμηλό ηλεκτρικό πεδίο) • ένα πιο αργό τελικό ηλεκτρολύτη (υψηλό ηλεκτρικό πεδίο) • Εφαρμογή στην SDS-PAGE με δύο buffer και δύο gel

29. 4. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑ - ΜΑΡΤΥΡΑΣ • SDS: Sodium dodecyl sulfate • Bromophenol blue • Θέρμανση ΠΗΚΤΗ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ (5 – 25%) • Ακρυλαμίδιο - πολυμερισμός • SDS ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ (BUFFER)

30. 4. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

31. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • ΚΥΡΙΩΣ ηλεκτροφόρηση μικρών πρωτεϊνών, χωρίς να μπορεί να μελετηθεί η τεταρτοταγής δομή των πρωτεϊνών • Ηλεκτροφόρηση μικρών μορίων DNA ή RNA και ολιγονουκλεοτιδίων

32. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

33. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

34. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

35. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

36. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

37. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

38. SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

39. 5. NATIVE PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ • Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα δεν εξαρτάται μόνο από το φορτίο και τη μάζα, αλλά και από το φυσικόσχήμα και μέγεθος της πρωτεΐνης • Blue native (BN) • Clear native (CN) • Quantitative Preparative Native Continuous PAGE (QPNC-PAGE) –

40. BLUE NATIVE PAGE (BN) • Η Coomassie Brilliant Blue φορτίζει τις πρωτεΐνες. • Λειτουργεί σαν αποδιατακτικό μέσο CLEAR NATIVE PAGE (CN) • Δεν υπάρχει χρωστική να φορτίσει τις πρωτεΐνες, • Κινούνται μόνο βάσει του φορτίου που αποκτούν μέσα στο buffer

41. QUANTITATIVE PREPARATIVE NATIVE PAGE (QPNC-PAGE) • Το buffer με pH 10,0 κινεί τις πρωτεΐνες. • Τα κλάσματα εκλούονται σε pH 8,0 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ • Προσδιορισμός συμπαραγόντων, π.χ. Fe, Cu, Zn, κλπ • Ποσοτικός Προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνών

42. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ • ΧΡΩΣΗ με • Coomasie Brilliant Blue ή • Silver • ΑΠΟΤΥΠΩΣΗ (WESTERN) γιατί • Δεν μπορεί να αποθηκευτεί η πηκτή • Πρέπει να ταυτοποιηθούν οι πρωτεΐνες

43. WESTERN BLOTTING • Ακολουθεί ανίχνευση • ενζυμοανοσολογικά (Immunoblotting) • ραδιονοσολογικά • με χημειοφωταύγεια

44. WESTERN BLOTTING

45. ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ(IMMUNOFIXATION ELECTROPHORESIS, IFE) Καθίζηση ανοσοσυμπλεγμάτων – Ανίχνευση μονοκλωνικώνAbs ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ • Μετά από εύρεση παθολογικών τιμών λευκωμάτων στον ορό • Παρουσία λοίμωξης • Διευρεύνηση πιθανού πολλαπλού μυελώματος ή υποτροπιαζουσών λοιμώξεων ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗΣ • Όταν βρεθεί παθολογική «ζώνη» μονοκλωνικήςανοσοσφαιρίνης στην ηλεκτροφόρηση

49. 6. ΤΡΙΧΟΕΙΔΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ(Capillary electrophoresis) • Ηλεκτροφορητικό μέσο: υγρό - ηλεκτρολύτης • Εφαρμογή : Διαχωρισμός ιόντωνή νουκλεοτιδίων βάσει φορτίου • Οπτικοποίηση: UV, φθορισμό, φασματογράφο μάζας

50. 6. ΤΡΙΧΟΕΙΔΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ(Capillary electrophoresis)