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IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE

IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE. RESPUESTA INMUNE HUMORAL. SEROLOGÍA. suero. estudio. “Ciencia de la detección de anticuerpos”. Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines diagnósticos, a partir del suero de un animal. Sensibilidad.

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IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE

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Presentation Transcript

  1. IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE

  2. RESPUESTA INMUNE HUMORAL SEROLOGÍA suero estudio “Ciencia de la detección de anticuerpos” Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines diagnósticos, a partir del suero de un animal.

  3. Sensibilidad Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos” (VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”. Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA Especificidad Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos” (VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”. Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING

  4. Animal ENFERMO SANO + Positivo verdadero Falso positivo Prueba - Falso negativo Negativo verdadero

  5. CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL • PRIMARIAS Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in vitro • SECUNDARIAS Miden las consecuencias o el efecto protector de anticuerpos en el animal (in vivo) • TERCIARIAS

  6. Ig M Ig G Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus Ig M Post-infección Natural Ig G Post- Vacunación B. abortus cepa 19

  7. Respuesta inmune humoral Brucella abortus Isotipo Cantidad Presencia Características IgM Abundante Temporaria Inespecífica ? IgG1 Abundante Continua Específica IgG2 Escasa Discontinua Específica IgA Abundante Discontinua Específica

  8. APLICACIONES EN R. A. BRUCELOSIS BOVINA Resolución 438/2006 del SENASA.

  9. PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS ELISA Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del sustrato específico, producen una reacción colorimétrica. ENZIMAS UTILIZADAS •PEROXIDASA • Fosfatasa alcalina SUSTRATO • ortofenildiamina • paranitrofenilfosfato

  10. ELISA Tipos de pruebas INDIRECTA SANDWICH COMPETICIÓN detección de ANTICUERPO detección de ANTÍGENO detección de ANTICUERPO

  11. ELISA INDIRECTO Lavado Lavado Lavado ANTÍGENO adsorbido (reactivo) Suero PROBLEMA ANTIGLOBULINA marcada con ENZIMA (reactivo) SUSTRATO de la enzima (reactivo) Detección de ANTICUERPOS CAMBIO DE COLOR

  12. ELISA COMPETICIÓN COLOR NEGAT I VO Lavado Lavado Lavado Lavado Suero Problema Ac monoclonal Conj. con enzima peroxidasa Sustrato cromógeno Antígeno POS I T I VO Y Y Y Y Lavado Lavado Lavado Lavado AUSENCIA DE COLOR

  13. VENTAJAS DESVENTAJAS • Alta sensibilidad y especificidad • Rápido • Reactivos estables • Resultado visual • Costo microplacas • Costo equipo automatización ELISA APLICACIONES EN VETERINARIA • Cuantificación de inmunoglobulinas • Brucelosis • IBR • BVD • Peste porcina • Aujesky • Newcastle • Babesia • Trichinella • Toxoplasma • Toxocara • Hormonas • Micotoxinas • Bia • Leucemia felina • Salmonella • Aftosa • Estreptococos • TBC

  14. PRUEBAS SECUNDARIAS

  15. La prueba a realizar depende de las características del Ag • SOLUBLE • PARTICULADO • SUPERFICIE + COMPLEMENTO PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

  16. Y Y Y Y Y Y Y Comparación precipitación - aglutinación Antígeno SOLUBLE Antígeno PARTICULADO Anticuerpo Y Formación de “retículo” “Amontonamiento” Y Y AGLUTINACIÓN PRECIPITACIÓN

  17. AGLUTINACIÓN Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo: bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión agruma, produciendo una reacción de aglutinación.

  18. FENÓMENO DE ZONA O PROZONA Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de sueros muy positivos.

  19. Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Proporción + Antígeno particulado (reactivo) AGLUTINACIÓN Suero problema Medio

  20. En PLACA En TUBO AGLUTINACIÓN Salmonella Brucella Micoplasma Brucella BPA SAT+2-ME PAL

  21. Aglutinoscopio + placa de vidrio Aglutinación en placa: BPA Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado 1. Suero problema 2. Antígeno específico (reactivo)

  22. 8 MINUTOS LECTURA E INTERPRETACIÓN 3. Mezclar Con GRUMOS Sin GRUMOS AGLUTINACIÓN POSITIVA Negativa

  23. Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME SAT (Seroaglutinación en Tubo) + Se realizan en simultáneo Ig M Ig G 2- ME (2- Mercaptoetanol)

  24. 1/50 1/25 1/100 1/200 En TUBO: SAT + 2- ME 2. Solución fisiológica fenicada (SFF) 1. Suero problema 3. Antígeno 60 MINUTOS SUERO BPA (+) SAT 37ºC-48 hs Título 2-ME 2. Solución 2-ME

  25. LECTURA e INTERPRETACIÓN 37ºC-48 hs INCOMPLETA NEGATIVA POSITIVA

  26. FIJACIÓN DE COMPLEMENTO Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene hemólisis.

  27. FIJACIÓN DE COMPLEMENTO 2 sistemas Sistema de PRUEBA Sistema INDICADOR • Suero problema • Antígeno específico • Complemento • Eritrocitos • Hemolisina (Ac. anti eritrocitos)

  28. Y Y Y C C FIJACIÓN DE COMPLEMENTO SIN HEMÓLISIS Eritrocitos Antígeno Y POSITIVO Suero problema Complemento Ac antieritrocitos Con HEMÓLISIS Y - Negativo Suero problema

  29. APLICACIONES EN VETERINARIA • BRUCELOSIS • IBR • DVB • AFTOSA • MOQUILLO CANINO • TOXOPLASMOSIS

  30. POLARIZACIÓN FLUORESCENTE (FPA) • Fundamento: Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo, enfrentando el suero de un animal enfermo de brucelosis con una fracción de del antígeno de bruecella (cadena O), este complejo forma una masa grande que en suspensión gira mas lentamente . Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados de despolarización en función de su velocidad de rotación.

  31. Aglutinación en tubo: PAL PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE Fundamento: si en una muestra de leche se encuentraun anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno particulado coloreado, ambos se unirán, formando un complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y asciende con la nata

  32. PAL 2. Antígeno (reactivo) 1. Leche problema LECTURA e INTERPRETACIÓN 37ºC-1 hora + ++++ ++ +++

  33. DESCANSO

  34. PRUEBAS MOLECULARES REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA HIBRIDOMA

  35. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Multiplicación de una secuencia de ADN específica y conservada de la especie a identificar, que puede ser visualizada y cuantificada

  36. NUCLÉOTIDO Base nitrogenada Fosfato Azúcar

  37. ADN AZÚCAR FOSFATO CADENA DE AZÚCAR Y FOSFATO BASE

  38. A T • NUCLEÓTIDOS G C • ADN • OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS) • POLIMERASA

  39. Polimerasa Primers Primers Polimerasa

  40. Desnaturalización 94º C 1 min Extensión 72º C 1 min 35 ciclos Hibridación 56º C 1 min ADN 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Primers Polimerasa dNTP Detección

  41. Producto de PCR para identificar Brucella spp en muestras de leche

  42. Producto de PCR para caracterizar cepas de Brucella abortus en muestras de leche

  43. FC + + + + + + + + + + + + + + + + + + - ELISA-C + + + + + + + + + + + + + + + + + + - ELISA-I + + + + + + + + + + + + + + + + + + - n=223 PCR B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. B. abortus silv. Cultivo - - - - - - - - - - - - - + - - - - - ID 11 17 33 58 61 113 168 172 189 242 255 1487 151 157 179 228 260 1380 124 37 % con B. abortus silvestre se infectó con RB51 0,8 % de las sanas se infectó con B. abortus RB51 (p<0,0001) B. abortus silv – RB51 B. abortus silv – RB51 B. abortus silv – RB51 B. abortus silv – RB51 B. abortus silv – RB51 B. abortus silv – RB51 B. abortus RB51

  44. Tipos de PCR • CON PRIMERS ANIDADOS • ASIMÉTRICA • INVERSA • MULTIPLEX • NESTED

  45. VENTAJAS • FIDELIDAD • SENSIBILIDAD • ESPECIFICIDAD • AUTOMATIZACIÓN

  46. APLICACIONES • Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas) • Enfermedades hereditarias • Enfermedades autoinmunes • OncologÍa • Medicina forense • Arqueología

  47. HIBRIDOMA

  48. M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M Selección in vitro en el medio HAT

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