基因工程 Gene Engineering

1. 高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材 基因工程Gene Engineering 彭银祥等编著 第1章 绪论 Introduction 华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷

2. 基因工程的概念 • 基因工程（Gene manipulation, recombinant DNA technology, Genetic engineering）将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内进行复制、转录和翻译表达的操作叫做基因工程。 • 包括：基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞中的保持、复制、转录和翻译表达等全过程。 • 遗传工程的概念有广义和狭义之分 传统遗传操作——杂交技术 现代遗传操作——基因工程 • 基因工程的理论基础 基于遗传学和分子生物学的发展

3. 1.1 基因工程的发展历史 • 1.1.1 基因工程的理论基础 • DNA作为遗传物质的证据 1 1928年，F. Griffith的转化实验。 1944年，Oswald Avery 报道转化的物质是DNA。 2 1952年，A. Hershey & M. Chase的噬菌体标记实验。 • RNA是遗传物质的证明 1955年，H. Fraenkel Conrat & B. Singer 证明了TMV是RNA病毒，它是一种遗传物质。

4. Oswald Theodore Avery 1944 O. Avery, C. MacLeod, M. McCarty Reported that they had purified the transforming principal in Griffith's experiment and that it was DNA.

5. 1952 A. Hershey & M. Chase Used phages in which the protein was labeled with 35S and the DNA with 32P for the final proof that DNA is the molecule of heredity. Martha Chase (1930-2003) Alfred Hershey(1908-1997)

6. 1950年 Erwin Chargaff 提出了Chargaff规则T=A C=G

7. 1951. King’s Lab. London University UK Maurice Wilkins & Rosalind Franklin (37y) unflattering portrayal of Franklin in his account of the discovery of DNA's structure, entitled "The Double Helix," depicts Franklin as an underling of Maurice Wilkins, when in fact Wilkins and Franklin were peers in the Randall laboratory. X~ray photograph of DNA with high quality (核塘与磷酸连接成的扭曲绳子，每一节上都有配对的碱基)

8. 1953年，Watson & Crick 提出了DNA双螺旋结构模型。 DNA的成分：磷酸、戊糖、四种碱基。 Erwin Chargaff rule M. Wilkins & R. Franklin

9. 1957年，Meselson-Stahl的半保留复制证明了这一学说的正确。1957年，Meselson-Stahl的半保留复制证明了这一学说的正确。 • 遗传物质的结构与传递规律（遗传信息流）

10. Marshall Nirenberg 遗传密码的破译 1965年，Nirenberg P. Leder 利用核糖体结合实验，完成了mRNA上编码20种氨基酸的三联密码子遗传密码的破译工作。破译了全部64个密码。Shared the 1968 Nobel Prize for Physiology or Medicine

11. 1.1.2 基因工程的技术源泉 1956年，Korngberg 从E. coli 中分离纯化了DNA聚合酶I这是能在试管中合成DNA的第一个核酸酶。The Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1959

12. Hamilton O. Smith Werner Arber Daniel Nathans 1.1.2 基因工程的技术源泉 • 限制性内切酶的发现 （a）细菌限制修饰系统的发现，W.Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 （b）限制酶HindII的发现，H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 （c）D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40 限制图谱和转录图谱。

13. 1.1.2 基因工程的技术源泉 • DNA连接酶是1967年 • Gellert M (NIH， Maryland) , • Olivera B.M.(Stanford school of Medicine, CA) Weiss B.( Harvard Medical School) • 三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-P与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。

14. Paul Berg 1.1.2 基因工程的技术源泉 • 1972年，斯坦福大学P. Berg小组完成了首次体外重组实验。在PNAS发表了题为“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法：含有噬菌体基因和E.coli半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”。 （用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶） 1980年Nobel化学奖

15. 2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。

16. Boyer-Cohen实验

17. S. Cohen 1986 Nobel生理或医学奖

18. Herb Boyer 1.1.2 基因工程的技术源泉 • 1972 Paul Berg & Herb Boyer Produced the first recombinant DNA molecules. They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA",

19. Howard Temin (41y) David Baltimore (37y) 1.1.2 基因工程的技术源泉 • H. Temin & D. Baltimore 从Rous 肉瘤中发现了反转录酶（reverse transcriptase ）（引发癌症的内因） • 某些RNA病毒能够以自身作为模板合成RNA。如，R17, f2, MS2和Q等。

20. 基因的概念及其发展 (1)早期的基因概念 • 是存在于DNA上并承载遗传信息的核苷酸序列；是染色体上呈现行排列的遗传物质的最小单位；是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。 • 随着分子生物学研究的深入，人们对基因的认识不断提高，发现了“等位基因”，“移动基因（movable gene)-转座子（transponsable element)”，“断裂基因” （Split gene, interrupted gene)，“重叠基因” （Overlapping gene) ， “假基因” （pseudo gene)。 • 是转录的功能单位，是编码一种可扩散产物的一段DNA序列，其产物可以是蛋白质或RNA。因此，一个完整的基因有编码区和调控区两部分组成。

21. 基因调控理论的突破 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965 Francois Jacob (44y) Jacques Monod (55y) (French) 提出了乳糖操纵子学说 Lac. Operon Theory （1961） Concept of mRNA

22. (2)调控基因概念的发展 “Lactose operation theory”提出后，相继出现了结构基因，启动基因、操纵基因、调节基因等概念。 把参与基因表达调控的基因分为两类： 一类是通过基因转录和表达的产物，反式作用因子（trans-acting factor) 另一类是起调控作用的DNA序列，顺式作用元件（cis-acting elements)

23. （3）现代的基因概念 ：含特定信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 基因可以分为： （1）能够编码多肽链一级结构的基因，如，结构基因； （2）能转录成RNA但不能翻译的基因，如，tRNA基因； （3）有功能意义，但根本不转录的基因，如，顺式作用元件； 真核的结构基因是指能够产生多肽链的一段DNA分子，由4个部分组成，即：前导区、尾部区、间隔区（内含子）、编码区（外显子）。

24. The Nobel Prize in Chemistry 1980 “for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids in 1975-1977" Walter Gilbert 1932 - Frederick Sanger 1918 - Biological Laboratories Cambridge, MA, MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, Great Britain 1.1.2 基因工程的技术源泉

25. 1.1.2 基因工程的技术源泉 • 1985 Kary B. Mullis Published a paper describing the polymerase chain reaction (PCR), the most sensitive assay for DNA yet devised The Nobel Prize in Chemistry 1993"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"

26. 1.1.2 基因工程的技术源泉 • 1996Patrick O. Brown, Professor of Stanford University presented the 'gene chip' containing 6116 different gene specific sequences of the yeast genome. This is of great benefit in mapping the genomes.

27. "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA“(2006) 1.1.2 基因工程的技术源泉 Andrew Z. Fire Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA Craig C. Mello University of Massachusetts Medical School

28. 受体系统研究 克隆载体研究 目的基因研究 基础研究 基因工程 应用研究 生物基因组学研究 生物信息学研究 1.2 基因工程的研究内容 • 1.2.1基因工程的概念 • 1.2.2 基因工程的研究内容

29. 1.2.3 基因工程的特点与基本流程 特点： 1 可以根据人们的意愿在DNA水平上进行事先设计和操作； 2 离体情况下，在分子水平上进行基因的重组操作； 3 在细胞水平上进行重组体的表达，这种表达可以在动物、植物细胞和微生物之间进行。

30. 基因工程的基本流程（主要操作内容） 1. 目的基因的获取（制备） 从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 2. 目的基因和载体DNA的准备 将目的基因的DNA片断和所用的载体用相应的内切酶切割，回收相应的线性DNA以备连接。

31. 4.重组体的转化 3. 重组体的制备 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 将重组体（连接产物）通过一定的方法转入适当的受体细胞中。

32. 5.克隆鉴定 通过一定方法挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。 6.目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

33. 基因工程的基本流程（主要操作内容）

35. 1.2.4 与基因工程相关的学科和技术 • 分子生物学 Molecular Biology • 生物化学 Biochemistry • 分子遗传学 Molecular Genetics • 发酵工程 Technology of Fermentation • 细胞培养技术 Technology of Cell Cultivation

36. 1.3 基因工程的应用 1.3.1 基因工程在工业领域的应用 1. 酿酒与食品工业 用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。 2. 污水处理与环保 用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。 3. 能源开发与利用 克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。

37. Biotechnology is not new. Cheese, bread and yoghurt are products of biotechnology and have been known for centuries.

38. 1.3 基因工程的应用 1.3.2 基因工程与农业 （1）转基因植物 (transgenic plants) • 抗虫基因（杀虫结晶蛋白基因） • 抗病基因 • 抗非生物胁迫基因 • 改良作物品质的基因 目的： 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。

40. Delay-ripening tomato Commercialized in the US First field tests 6/92 Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized First transgenic plant First Bt corn plants 6/90 ’83 ’84 ‘85 ‘86 ’87 ‘88 ‘89 ‘90 ’91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ’99 ’00 ‘01 ‘02 Rotting resistant tomato approved by FDA GM maize approved by EU

41. Genetically Modified (GM) Foods • Today, DNA technology is quickly replacing traditional plant-breeding programs • In 2002, roughly half of the American crops of soybeans and corn were genetically modified in some way

42. This corn has been damaged by the European corn borer • Corn has been genetically modified to resist insect infestation

43. “Golden rice” has been genetically modified to contain beta-carotene • Our bodies use beta-carotene to make vitamin A

44. Some Examples of Current Transgenic Plants Roundup Ready™ Soybeans Herbicides such as RoundupTM and Liberty LinkTM are able to kill a wide range of weeds. Development of herbicide resistant crops allows the elimination of surrounding weeds without harm to the crops.

45. Increase Yields Crops can be modified to optimize growth conditions: improve nitrogen assimilation, increase oxygen absorption, efficient photosynthetic pathway, and increase starch biosynthesis. Transgenic plant modified to have increase yield Unmodified control plant

46. Corn hybrid susceptible to European corn borer Corn hybrid with a Bt gene Insect Resistance Various insect resistant crops have been produced. Most of these make use of the Cry gene in the bacteria Bacillus thuringiensis (Bt); this gene directs the production of a protein that causes paralysis and death to many insects.

47. “Golden” rice Normal rice Golden Rice Transgenic technology produced a type of rice that accumulates beta-carotene in rice grains. Once inside the body, beta-carotene is converted to vitamin A. More than 120 million children in the world suffers from vitamin A deficiency. Golden Rice has the potential to help prevent the 1 to 2 million deaths each year caused by a deficiency in this vitamin.

48. Virus Resistant Crops Papaya infected with the papaya ringspot virus Virus resistance gene introduced

49. The Freedom II squash has a modified coat protein that confer resistance to zucchini yellows mosaic virus and watermelon mosaic virus II. Scientists are now trying to develop crops with as many as five virus resistance genes

50. Edible vaccines produced by transgenic plants are attractive for many reasons. The cost associated with the production of the vaccine is low, especially since the vaccine can be ingested directly, and vaccine production can be rapidly up scaled should the need arises. Edible vaccine is likely to reach more individuals in developing countries. The first human clinical trial took place in 1997. Vaccine against the toxin from the bacteria E.coli was produced in potato. Ingestion of this transgenic potato resulted in satisfactory vaccinations and no adverse effects.