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TERAPIA GÊNICA

TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS. TERAPIA GÊNICA. Aconselhamento Genético Prof a . Dr a . Ana Elizabete Silva. TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS.

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TERAPIA GÊNICA

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Presentation Transcript

  1. TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS TERAPIA GÊNICA Aconselhamento Genético Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

  2. TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS  Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo, embora frequentemente melhore a qualidade de vida dos pacientes amenizando os sintomas ao invés de agir na causa primária: o gene

  3. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO DOENÇAS MONOGÊNICAS -Tratamento se baseia na reposição da proteína deficiente → melhora do funcionamento ou minimizando as consequências de sua deficiência -efetivo em 12% dos distúrbios DOENÇAS COMPLEXAS – MULTIFATORIAIS -se o fator ambiental é conhecido: oportunidade efetiva de intervenção → modificação ou não exposição ao fator ambiental -tratamento cirúrgico ou médico Quanto mais precoce o diagnóstico e instituído um tratamento → mais favorável será a evolução dos pacientes.

  4. Transplante de órgão Ativação de um gene dormente Fornecimento da proteína Evitar o agente danoso Remoção do produto tóxico acumulado ADA e Talassemia: Medula óssea Talassemia Beta: Gene da cadeia  da hemoglobina Hemofilia B: fator IX de coagulação.Diabetes: insulina Xeroderma pigmentosum: luz solar Fenilcetonúria: dieta baixa de fenilalanina; D. Wilson: acúmulo de cobre TRATAMENTO AO NÍVEL DO FENÓTIPO AFETADO

  5. DOENÇAS MONOGÊNICAS COM TERAPIA EFETIVA • Hiperplasia adrenal congênita: reposição hormonal • Fenilcetonúria: restrição dietética de fenilalanina • Hemofilia: reposição do fator • Imunodeficiência combinada grave: transplante de medula • Cistinúria: ingestão de líquidos: D-penicilina • Agamaglobulinemia: reposição de imunoglobulinas • Acidúria metilmalônica: vitamina B12 • Doença policística adulta: transplante renal

  6. DOENÇAS MULTIFATORIAIS COM TERAPIAS EFETIVAS • Fenda labial e palatina: cirurgia • Estenose pilórica: cirurgia • Cardiopatia congênita: cirurgia e medicação • Hidrocefalia: cirurgia e medicação • Hipertensão: medicação • Úlcera péptica: medicação e cirurgia • Epilepsia: medicação

  7. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS • Necessidade de uma avaliação a longo prazo: o tratamento aparentemente bem sucedido pode demonstrar-se imperfeito • Após longa observação apresenta inadequações: Ex. PKU Manifestam distúrbios de aprendizagem e comportamento → prejuízo no desempenho acadêmico Crianças bem-tratadas→ escapam de RM → QI normal

  8. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS 2.Tratamento bem-sucedido de mudanças patológicas em um órgão → podem surgir problemas inesperados em tecidos, antes não observados (pacientes não sobreviviam tempo suficiente). Ex.: Galactosemia galactose-1-fosfato UDPG GALT Quadro clínico: Problemas gastrintestinais Cirrose hepática Catarata RM grave Criança tratada: Problemas de aprendizagem Mulheres desenvolvem insuficiência ovariana → toxidez continuada de galactose

  9. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS • Outros exemplos: • Cistinose: acúmulo de cistina nos lisossomos → insuficiência renal → pacientes com transplante renal após envelhecimento → desenvolvem hipotireoidismo, diabetes e anomalias neurológicas • Retinoblastoma: tumor de retina → pacientes correm o risco de desenvolver outras malignidades independentes após a primeira década: osteossarcoma

  10. CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS • Efeitos colaterais a longo prazo: Exemplos: • Hemofilia: infusão do fator de coagulação → formação de anticorpos contra a proteína • Talassemia: transfusão de sangue → sobrecarga de ferro

  11. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO

  12. TRATAMENTO DAS DOENÇAS METABÓLICAS

  13. Desvio Metabólico: Distúrbios do ciclo da uréia -conversão da amônia em uréia -defeito enzimático → hiperamonemia -benzoato de sódio → ligação da amônia com glicina → hipurato Inibição: Hipercolesterolemia Familiar Lovastatina: redução 40 a 60% nos níveis de LDL-colesterol do plasma nos heterozigotos

  14. TRATAMENTO NO NÍVEL DA PROTEÍNA

  15. TRATAMENTO POR MODIFICAÇÃO DO GENOMA OU SUA EXPRESSÃO

  16. TRANSPLANTE DE MEDULA ÓSSEA: DOENÇAS DE ARMAZENAMENTO LISOSSÔMICO

  17. Terapia Gênica Envolve diversas tecnologias que têm em comum, um novo conceito terapêutico a introdução de material genético para atuar na causa fundamental da doença :o gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos • Descreve qualquer processo destinado a tratar ou aliviar doenças pela modificação genética das células do paciente.

  18. PROPÓSITOS DA TERAPIA GÊNICA • Compensação: gene mutante com perda de função • Substituição: gene mutante dominante (difícil)  alternativa: degradação do mRNA mutante (ribozimas ou RNA de interferência) • Efeito farmacológico: contrabalancear os efeitos de um gene mutante ou compensar a patogenia da doença, como no câncer

  19. FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GÊNICA • Terapia gênica germinativa • Terapia gênica somática

  20. TERAPIA GÊNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS • Terapia ex vivo:as células do paciente são retiradas e manipuladas fora do corpo • Terapia in vivo:as células são tratadas dentro do corpo

  21. 1. Inserção de um gene em um vetor 2. Contato Vetor / Célula 3. Entrada e transporte do gene até o núcleo da célula 4. Transcrição do RNAm a partir do gene 5. Tradução do RNAm em proteína 6. Secreção, fixação na membrana ou expressão citoplasmática da proteína

  22. PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA Doença apropriada Estratégia de transferência: ex vivo ou in vivo Células alvo Vetor

  23. CÉLULAS ALVO Características: acessíveis, tempo de vida longo no corpo, alta taxa de proliferação Tipos de células alvo: • Células tronco (medula óssea- cordão umbilical) • linfócitos • fibroblastos de pele • células musculares (mioblastos) • células vasculares endoteliais • hepatócitos

  24. Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos: A- Técnicas que utilizam métodos físicos ou químicos: baixa eficácia e transitório • microinjeção • precipitado de fosfato de cálcio • eletroporação (choque elétrico) • lipossomos • biobalística (gene gun)

  25. precipitado c/DNA- endocitose (cultura celular – ex vivo) Microinjeção: núcleo da célula (terapia ex vivo ou in vivo- embrião) vesícula m. lipídica Eletroporação: choque elétrico→poros (morte celular) Bombardeio partículas de ouro: bomba de hélio (morte celular)

  26. Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos: B- Técnicas que utilizam vetores biológicos: • retrovírus • Adenovírus • Adenovírus associado-AAV (parvovírus) • Lentivírus (retrovírus → cels. não dividem) • Herpes vírus (invadir neurônios) • Cromossomo artificial

  27. CROMOSSOMO HUMANO ARTIFICIAL • 5-10 Mb • DNA telomérico humano • DNA centromérico • DNA genômico • Introduzidos em células em cultivo (lipofectina)

  28. RETROVÍRUS • Retrovírus (vírus de RNA) são os vetores ideais para a transferência de genes em células humanas: • são capazes de infectar quase 100% das células-alvo em divisão→ integra no genoma hospedeiro • carregam fragmentos relativamente grandes de DNA (8kb) • Desvatagem:infectam somente células em divisão

  29. Gag: proteína cápsula interna Env: transcriptase reversa e integrase Pol: envelope glicoproteína 1. DNA Humano 2. Célula reparada por terapia gênica

  30. Terapia Gênica • A inserção casual do DNA no genoma das células hospedeiras pode : • inativar um gene importante: morte celular • ativar um oncogene: alterar o padrão normal de controle e divisão celular • causar mutação

  31. OUTROS VETORES VIRAIS • PARVOVÍRUS:vantagem de integração estável ao DNA (ou epissomo); células com/sem divisão; nenhuma associação conhecida com doença humana: Desvantagem: inserção de DNA de cerca de 5kb • HERPES VÍRUS desativado:capacidade de invadir neurônios. Desvantagem: não se integram aos cromossomos: inviabiliza expressão a longo prazo

  32. http://www.eurordis.org/article.php3?id_article=1006

  33. Pré-Requisitos : Terapia Gênica • escolher a doença apropriada a ser tratada • identificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras • assegurar que o gene inserido não tenha efeitos prejudiciais • determinar as células-alvo certas que tenham duração de vida adequada • verificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução do gene nas células • restringir a transferência do gene às células alvo somáticas • documentar e divulgar os resultados obtidos

  34. Classes de Doenças Passíveis de Terapia Gênica • Doenças Hereditárias (monogênicas) • Neoplasias • Doenças infecciosas (AIDS) • Outras Doenças: doença arterial coronária; artrite; doença renal, etc • Cerca de 650 protocolos aprovados

  35. Algumas tentativas de terapia gênica : • Deficiência da enzima desaminase de adenosina (ADA) • Imunodeficiência combinada severa ligada ao X (XSCID) • Fibrose Cística • Hemofília • DMD • Hipercolesterolemia Familial: LDLR (receptor de lipoproteína de baixa densidade) • Câncer • AIDS

  36. Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA) • Doença imunológica rara: debilitação do sistema imune (imunodeficiência) • Enzima ADA: via purinas (tóxica) • linfócitos T (células-alvo) são muito acessÍveis • grande variação no nível de expressão do gene ADA entre indivíduos normais • o primeiro protocolo aprovado para terapia gênica foi para a correção da deficiência da ADA. 1990: Drs. Anderson e Blease (Ashanti De Silva)

  37. ADA • linfócitos T foram coletados e expandidos em cultura ex vivo infectadas com retrovírus recombinante • os linfócitos foram injetados nos pacientes • expressão do gene ADA detectada por 12 anos nos linfócitos periféricos • transferência do gene não foi eficiente: receberam PEG-ADA

  38. DEFICIÊNCIA DA DESAMINASE DE ADENOSINA - ADA • NOVA TÉCNICA: • gene ADA transferido para células tronco: sangue do cordão umbilical • 10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normal • tratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA) foi removida progressivamente • Células T expressando ADA  significantemente

  39. IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA SEVERA LIGADA AO X - XSCID • Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia  do receptor IL-2 • Pacientes faltam células T e células B prejudicadas • França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica: células da medula óssea retrovírus • 9/10 crianças apresentaram células T com o gene transduzido • Duas crianças desenvolveram leucêmia de células T ~ 3 anos após a terapia inserção do retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2 (fator de crescimento)

  40. FIBROSE CÍSTICA • gene mutante:CFTR - 7q31-32 (AR) • proteína reguladora de condutância transmembrana:transporte de Cl- diminuído e do Na+ aumentado

  41. Fibrose Cística vetor adenoviral:infecta os pulmões, penetra em células que não estão em divisão sem integrar no seu DNA, permitindo que estas expressem o DNA viral, introduzido pelo nariz com um spray desvantagem:inflamação com ataque imune que neutraliza as células contendo gene adenoviral; efeito da terapia de vida curta, cerca de 6 semanas

  42. TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA • Mutação no gene do fator VIII de coagulação • afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X) • Sintomas: sangramento espontâneo nas juntas, nos tecidos moles e órgãos vitais • Tratamento: injeções regulares de fator VIII

  43. TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA 6 pacientes submetidos à terapia gênica • Procedimento: • extração de células da pele (fibroblastos) • inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição pelo organismo) inseridos nos fibroblastos por choque elétrico clonagem dos fibroblastos • pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem, após pequenas incisões • aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes) • benefícios foram temporários: apenas 10 meses

  44. VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA • Universidade de Pensilvania:rapaz de18 anos faleceu durante sua participação em uma triagem de TERAPIA GÊNICA • Doença: deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC): doença genética ligada ao X  distúrbio do ciclo da uréia (fígado)  causa níveis impróprios de amônia no sangue Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhões de adenovírus)  injeção no fígado  altos níveis de IL-6  consequências sistêmicas  síndrome de resposta inflamatória sistêmica letal

  45. TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER • Cerca de 420 protocolos: • 2/3 dos protocolos de terapia gênica em estudo envolvem cânceres não herdados • introdução de genes supressores de tumor para restaurar a função perdida. Ex.: inserção gene TP53 normal em tumores de pulmão bloquear a progressão tumoral e apoptose • Imunoterapia: introdução de lipossomos com DNA para HLA-B27 em melanoma: expressão de HLA-B27 na superfície das células e destruição pelas células T citotóxicas  regressão do melanoma em alguns casos

  46. TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER • Terapia "antisense“: bloqueia a tradução de mRNA transcritos por genes tumorais (Ex:VEGF, c-Fos) • Terapia pró-droga ou gene suicida: transferência de um gene (HSV-tk) que torna as células em divisão sensíveis a drogas selecionadas • Tripla hélice: TFO ligam-se ao DNA duplex → bloqueia expressão gênica • Ribozima: moléculas de RNA → clivam RNA

  47. AS: 15-20 pb ou complementar ao mRNA inteiro  bloqueiam os fatores de iniciação da tradução ou interação do mRNA e ribossomos. Ex.: AS complementar ao VEGF AS Oligos nucleases-resistentes

  48. Terapia pró-droga

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