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A Genética Molecular em Análises Clínicas

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38 diapositives · 545 Views · Oct 06, 2014

A Genética Molecular em Análises Clínicas. PROTEGER A AMOSTRA DNAses/RNAses Luvas Cobertas de banca Materiais M.B. Grade Descontaminar bancas. EVITAR CONTAMINAÇÕES Pontas de filtro Luvas 3 Zonas Distintas Descontaminar bancas. Cuidados Básicos no Laboratório. PRECISÃO MÁXIMA

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  1. A Genética Molecular em Análises Clínicas Prof.Doutor José Cabeda

  2. PROTEGER A AMOSTRA DNAses/RNAses Luvas Cobertas de banca Materiais M.B. Grade Descontaminar bancas... EVITAR CONTAMINAÇÕES Pontas de filtro Luvas 3 Zonas Distintas Descontaminar bancas... Cuidados Básicos no Laboratório • PRECISÃO MÁXIMA • Confirmar volumes • Tempos e Temperaturas exactos

  3. PREPARAÇÃO DE DNA E RNA • DNAses e RNAses • Omnipresentes em todo o material biológico: • Função biológica essencial • Presentes em todo o material de vidro e de plástico não tratado convenientemente • Presentes em químicos não “Mol.Biol.Grade” • Presentes nas mãos de todo o pessoal de laboratório

  4. Descontaminar bancas e equipamento

  5. Pontas para múltiplos volumes

  6. Pontas com marcas de volume

  7. Pontas para tubos longos

  8. Pontas para Geis

  9. Pontas para DNA Genómico

  10. Os tubos eppendorf:

  11. A Genética Molecular em Análises Clínicas Preparação de Ácidos Nucleicos Prof.Doutor José Cabeda

  12. Preparação das células:pulverização pós congelação

  13. Preparação das células:homogeneização

  14. Preparação das células do sangue:Centrifugação em gradiente descontínuo de densidade (Ficoll)

  15. Preparação das células do sangue:Lise dos eritrócitos

  16. PREPARAÇÃO DE DNA E RNA • DNA e RNA de mamiferos: • Lise suave e solubilização do DNA/RNA • Destruição enzimática das proteínas (proteases) • Destrição e precipitação quimica das proteínas (fenol/clorofómio/ácido isoamilico) • Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) • Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia remoção de sais)

  17. Método do fenol/ clorofórmio

  18. Método do salting-out

  19. PREPARAÇÃO DE DNA E RNA • DNA e RNA bacteriano • Como a dos mamíferos, mas é necessário ser eficaz na separação de polissacáridos, muito abundantes em algumas bactérias: • CsCl • Enzimas: • Lisozima • Lisostafina • etc

  20. Ultracentrifugação em gradiente de densidade (CsCl)

  21. Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica

  22. Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH

  23. Colunas de sílica (ex. Qiagen)

  24. Formato de 96 poços

  25. DNA Genómico

  26. Vacuo Versus Centrifugação

  27. Qiagen Biorobot 9600

  28. Qiagen Biorobot 9604

  29. Silica Método de Boom Sample + Lysis buffer GuSCN Nucleic acid Wash Proteins and Lipids Elution buffer processing time 10 samples/1.5h Centrifugation Purified Nucleic acid

  30. Full Blood Serum/plasma PBMC/PBL Sputum Urine Brain tissue Spleen tissue Liver tissue Faeces Throat swabs Dermal lesions swabs Cerebro spinal fluids Cervical smears Pus samples Foodmatrices “Boom” compatible Sample Types Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990

  31. NuclisensExtractor

  32. Unidade Principal

  33. Baía dos reagentes

  34. Cartridge modules

  35. As cartridges

  36. MagnaPure (Roche)

  37. MagnaLyser

  38. Outros sistemas automáticos