Università di Trieste e Padova Ingegneria Chimica

1. Università di Trieste e PadovaIngegneria Chimica MOSE Molecular Simulation Engineering Laboratory - CASLAB Supervisore: Prof.ssa Sabrina Pricl Ricerca di Dottorato Maria Silvia Paneni XIX Ciclo

2. Tesi Titolo: “Studio funzionale di proteine coinvolte in patologie generali e virali con tecniche di simulazione molecolare assistite al computer”

3. Le Proteine a) Il malfunzionamento (uomo) b) La Buona attività (Microrganismi:Virus Batteri, funghi) Patologie

4. Approccio Interpretazione Termodinamica di: a) Relazione Causa – Effetto del cattivo funzionamento; • Legame Farmaco – Proteina: _Wilde Type = Attività _Mutazione = Resistenza.

5. Obbiettivo Determinare una “Chiave” Supporto della ricerca farmacologica Modello Molecolare RAZIONALE- COMPUTAZIONALE Per interpretare e prevedere Modello Clinico Fenomeni Chimico -Fisici Ing.Chimica Informatica Letteratura Enti di ricerca Scambi Culturali

6. 1. FHM - HCM 1.Studio delle relazioni genotipo-fenotipo delle mutazioni della β-Miosina coinvolte in patologie come la cardiomiopatie ipertrofiche

7. 1.1 Introduzione HCM: Eziologia oscura: Ipertrofia, disordinedei miociti , aumento del tessuto connettivo Mutazioni della βMHC (50% dei casi) Beta-miosina + Actina = attività ATPasica driving-force (power – stroke) della contrazione “Iprocessi di rimodellamento possono essere meccanismi compensatori “(Cell vol 104, 557-567)” “il cuore diventa più grande per compensare la riduzione della forza\potenza“(Miller et al 2003) Cardiovascular Istitute,University of Colorado at Denver, CO USA Obiettivo :Cercare un RAZIONALE tra il Modello Molecolare e quello Clinico

8. 1.2 Metodologia • Modellazione con omologia della 3D β-MHC • VALUTAZIONE del ΔΔGbind tra • COMPLESSO WT e MUTANTE • ΔΔGbind=ΔGbind(WT) - ΔGbind(MUT) • ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS • metodo Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA-Kollman’90),utilizzando i dati ricavati con dalla Dinamica Molecolare • ΔΔGbind<0 Complesso WT più Favorito del Mutante

9. 1.3 Risultati / Conclusione Abbiamo ottenuto ΔΔGbind < 0 Ecco il RAZIONALE : Mut= Meno energia Ridotta Driving Force LOSS on FUNCTION EFFETTO COMPENSATORE: SLITTAMENTO delle miofibrille dal loro assetto naturale ed INGROSSAMENTO del tessuto miocardiaco MIOCARDIOPATIA IPERTROFICA

10. 1.4 Collaborazione Molecular Genetics Laboratory of the University of the Colorado, Cardiovascular Istitute, Denver, CO USA;

11. 2. Antivirali - HIV 2. Studio e sviluppo di principi attivi anti – HIV: Resistenza a_Studio Farmacoforo della resistenza dell’HIV a farmaci inibitori della HIV- TI b_Studio della Resistenza dell’HIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Inversa

12. 2. Introduzione 21.8 milioni fino ad oggi i casi di decesso per AIDS nel mondo I due siero tipi HIV1 e HIV-2 appartengono alla famiglia dei Retrovirus che è una sotto classe dei Lentivirus; Approccio: TI Mutazioni Complesso Inattivo Inibitori NNIs e NIs + = Resistenza = mutazioni per vincere il farmaco Errore di trascrizione Obiettivo Valutare la Resistenza del HIV a inibitori della TI

13. 2a. Metodologia 2a.Studio Farmacoforosu Indoli : Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend dicomposti con attività nota nel caso wt e K103N e Y181C. Abbiamo stimato l’attività dei nuovi composti“mappandoli “in tali modelli( EC50 = concentrazione M del farmaco necessaria per bloccare l’attività del virus in cellula del 50%. ) Modello 3D per HIV-1 (es) monomutante-Ricavato da trend di composti con attività nota • Fucsia: Donatore legame idrogeno;HBDn • Verde: Accettore legame idrogeno ;HBAc • Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr

14. 2a. Risultati / Conclusione • Concordanza dati sperimentali e stimati • Previsioni accettabili di attività; • Sono circa 2000 con ottime attività antivirali oggetto di studio di Idenix-Novartis. • I modelli 3D ottenuti sono risultati adeguati per affrontare questo caso di studio sulla Resistenza

15. 2b. Metodologia 2b.Studio con Modellazione Molecolare della Resistenza dell’HIV-1 agli inibitori Non Nucleosidici della Transcrittasi Inversa: Analisi dellaVa =variabilità dei residui nel sito allosterico di legame NNRTIs - HIV-RT derivata sulla base della sequenza di differenti specie. Le (SCR)s hanno caratteristiche funzionali. E valutare se Residuo Candidato a Resistente GV = ΔGAA * Va ΔGAA contributo di energia libera di legame di un dato amminoacido derivante dalla dinamica molecolare < - 0.35Resistente 10xKi Wang and Kollman,2001,parametro empirico

16. 2b. Risultati / Conclusione • Perfetto accordo con i dati in letteratura riguardo ai residui resistenti; • Ottime previsioni su residui resistenti. • Per il 9-CL TIBO : • Residuo Letteratura GV • Y181 Y181C - 2.4 • K103 K103N - 3.9 • Per il 8-CL : • Residuo Letteratura GV • Y181 Y181C - 1.3 • K103 - - 0.41 Valida metodologia di carattere predittivo sulla Resistenza dell’HIV ai farmaci , utile per il design di migliori

17. The winner is Il suddetto lavoro dal titolo “Prediction of HIV-1 Resistance to NNRTIs: a Computer-aided Molecular-based Rationale“ ,ed I relativi risultati sono stati presentati al “International Conference HIV DART 2004”, Montego Bay-Giamaica 11-19 dicembre 2004 ed è stato riconosciuto tra tutti quelli presenti come il migliore . Collaborazione : Idenix - Novartis Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche dell’Università di Cagliari

18. 3. Antivirali - HCV 3. Studio e sviluppo di principi attivi anti HCV a_Studio Farmacoforo di Diketoacidi Inibitori della NS5B b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-polymerase

19. 3. Introduzione Il 3% della popolazione mondiale è cronicamente Infetta. 85% Cronicizzazione 20% Cirrosi 75%Epatocarcinoma Pestivirus(BVDV) Hepacivirus(HCV) Flaviviridae Similarità Genomica (RNA+) Flavivirus (YFV) Dengue fever virus (DENV)) Bassa repilcabilità in vitro Test in vitro su BVDV Complesso Inattivo Inibitori NNIs e NIs + = NS5B Obiettivo : Valutazione dell’attività di Inibitori Non nucleosidici e Nucleosidici della NS5B – RNA dipendente – RNA Polymerase

20. 3a.Metodologia 3a.Studio Farmacoforosu NNI - Diketo acididerivati: Abbiamo costruito un modello 3D di attività utilizzando un trend di 40 molecole con attività note . L’abbiamo testato su un 29 composti noti Abbiamo stimato le attività su nuovi DKAs derivati : • Modello 3D di Attività • Blue:Negativo ionizzabile; 1Neg I • Verde: Accettore legame idrogeno ; 2HBAc • Light blue: Idrofobico aromatico;HyAr

21. 3a.Risultati / Conclusione In generale venivano mappati sempre 1HB Ac ( N, O ), Neg I ( al gruppo carbossile ) e 1HyAr ( Ring) Per il 90% era mappato il secondo HB Ac Per il 70% l’altro Hy Ar Concordanza tra I dati sperimentali e stimati ottime previsioni; N N 2 Activ:0.056 (M ) Estimate: 0.096 (M ) N28 Activ:30 (M ) Estimate : 25 (M ) Il modello è risultato valido per la stima di nuovi Diketo acidi derivati inibitori della NS5B dell’HCV

22. 3a. Conclusione I risultati di tale lavoro sono contenuti nel articolo dal titolo:“A simple but effective three-dimensional chemical feature-based pharmacophore model for diketo acid derivatives as hepatitis C virus RNA-dependent RNA-polymerase inhibitors “, Journal of Medicinal. Chemistry (2005)vol 48, pp.6304-6314 Collaborazioni: “Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti"-Dipartimento di Studi Farmaceutici, Università di Roma

23. 3b. Metodologia 1 3b_Studio di NI - Nucleosidi analoghi come inibitori dell’HCV RNA dipendente RNA-polymerasecon la Modellazione Molecolare: Note le attività e i siti allosterici 1 de Shire A, Shire B e Pfizer 1: a 35A dal sito attivo. Recentemente scoperta l’esistenza di un sito allosterico 2 di legame superficiale specifico per rGTP, locato a 30 Ǻ dal sito catalitico, nella interfaccia dita- pollice Alcuni HNIs AD1 e AD2 , avevano mostrato un’attività confrontabile con quella della Ribavirina (unico NI in commercio) 2 NS5B Base Azotata Abbiamo modificato i gruppi funzionali e base azotata e valutato con la dinamica molecolare ΔGbind per ogni complesso doccato NS5B – HNI per il BVDV e HCV e calcolato le attività ΔGbind = RTlnKdissRTlnIC50 Kroeger Smith,2000;Wang et al. 2001 IC50 : concentrazione Mdel farmaco necessaria per bloccare del 50% l’attività dell’enzima puro .

24. 3b. Risultati • Procedura validata: testata per i tre inibitori conosciuti ShireA e ShireB e Pfizer 1:Concordanza con l’attività sperimentale e la struttura cristallografica note • Concordanza dati sperimentale e calcolati; • Ottime previsioni ; BVDV HCV La metodologia computazionale è risultata valida per la verifica e predizione dell’attività di inibitori su HCV

25. 3b. Risultati / Conclusione I risultati di tale lavoro sono contenuti nel manoscritto, dal titolo:”Hindered Nucleoside analogs as inibitors of HCV RNA-dependent RNA-polymerase: evolving visitas” che è pubblicato in “Framing the knowledge of viral hepatitis”, edited by Rymond F.Schinasi, and E.R. Schiff, IHL Press Arlington MA,US, pp. 279-318 (2005) . Collaborazioni : Dipartimento di Scienze Farmaceutiche - Università di Ferrara, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche , Sezione di Microbiologia , Virologia Generale e Biotecnologie Microbiche e Laboratori Cooperativi Idenix - Università di Cagliari.

26. 4. Antifungini – Antibatterici 4. Studio Sperimentale e Computazionale dell’attività Antifungina e Antibatterica di nuovi Imidazoli e Triazoli derivati

27. 4.1 Introduzione Candida = Funghi M.Tuberculosis = Bacteria Derivati Azolici = Antifunginie Antibatterici (gram positivi) Stesso meccanismo :Inibizione de lanosterolo C-14αdemetilasi, dipendente dal citocromo P450, Eme – thiolata proteina Complex:P450 – Inibitore Azolico (struttura cristallografica) Obiettivo: Valutazione dell’attività di Nuovi Derivati Azolici (imidazoli e triazoli)antifungini e anti batterici

28. 4.2 Metodologia 4.2.1 La Chimica :Sintesi e Test di Attività di Nuovi derivati Azolici (C.Albicans ,Glabrata M.Tuberculosis) La parte aryl - azolyl – etano legata con legame azometino alla piridina -2- carboxamidrazone , una parte chimica che è strato dimostrato possedere un importante attività anti mycobacterica ; presso l’Istituto di Scienze Farmaceutiche di Trieste .

29. 4.2Metodologia 4.2.2 La Modellazione Molecolare: a) Homology Modeling:3DP450-Candida Albicans • La struttura del citocromo P450 -14 DM del M.Tuberculosis era disponibile presso il Protein data bank codice : 1E9X • Costruzione del modello 3D per Candida Albicans .Alta conservazione della struttura delle omologhe P450s.Allineamento delle sequenze aminoacidiche del citocromo P450 della C. Albicans , C. Tropicalis , C. Glabrata , C. Krsuei e M. Tuberculosis. SCR Foglietti Eliche

30. Homology modeling Struttura 3D de citocromo P450 Candida Albicans Centro attivo della catalisi : ilnucleo di Fe- protoporphyrin ( eme)

31. b)Interazione Enzima - Farmaco Modellazione dei nuovi composti Byopolimer Modulo di INSIGHTII Docking del farmaco all’interno del sito attivo del P450 Calcolo dell’Energia di Legame: ΔGbind ΔGbind =ΔEMM +Δ Gsolv – TΔS < 0 L’energia libera di legame ΔGbind di ciascun complesso farmaco – 14 DM in acqua è stato calcolato in accordo alla così chiamata procedura Molecular Mechanics/ Poisson –Boltzman Surface Area (MM/PBSA) Kollman’90

32. 4.3 .1Risultati - La Chimica MIC MIC MIC MIC MIC=Conc.Minima Inibente (mg/L)-48h Candida-8g TBC I nuovi Azoli hanno dimostrato attività antifungina e antibatterica. Analogia per I microrganismi – I composti 2b e 2c (quelli alogenati Br e Cl) con circa 1mg/l (Candida ) e 4mg/L ( Tuberculosis) sono risultati I più attivi. I triazoli I meno attivi. Non additività per Il 2 – pyridinecarbox-amidrazone .

33. 4.3 .2Risultati-ll Computazionale M.Tuberculosis • Concordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibrio dalla dimanica molecolare di composti doccati nel sito attivo 2C 2L

34. 4.3.2Risultati–Il Computazionale C.Albicans • Concordanza Struttura cristallografica con Configurazioni di equilibriodalla dimanica molecolare di composti doccati nel sito attivo 2C 2L

35. 4.3.2Risultati–Il Computazionale M.Tuberculosis–(kcal/mol) C.Albicans – (kcal/mol)

36. 4.4 Conclusione Concordanza fra dati calcolati e sperimentali L’evidenza computazionale con i dati sperimentali è utile per il design di nuovi inibitori Azolici

37. 4.4 Conclusione I risultati di tale lavoro sono publicati nel seguente articolo : “Antifungal and antimycobacterial activity of new imidazole and triazole derivates. A combined and computational approach”.Journal of Antimicrobial Chemotherapy., July (2006); vol 58, pp. 76 – 84; Collaborazioni: Laboratorio di Microbiologia , Dipartimento di Scienze Biomediche e Dipartimento di Scienze Farmaceutiche di Trieste

38. Concludendo Goal: E’Stata fornita Una Chiave Razionale – Computazionale Per interpretare e predire il funzionamento delle proteine coinvolte in patologie generali e virali. La modellistica molecolare integrata all’analisi clinica è un valido strumento per la ricerca nel campo medico-farmaceutico .

39. Ringraziamenti Dott.ssa Mestroni L. Prof.ssa Mamolo M.G. Prof.ssa Banfi E. Prof. Vio L. Prof. La Colla P. Prof. Di Santo R. Prof. Manfredini S. Idenix - Novartis Staff del MOSE-CASLAB