Kantasolut ja Soluterapia

1. Kantasolut ja Soluterapia Mika Pietilä Luentosarja TKK, 11-26.02.2010

2. Solutuotteiden Karakterisointi: Laatukriteerit

3. Mitä karakterisointeja vaaditaan soluterapiatuotteilta? • EU:n lainsäädäntö (EMEA) • Soluterapiatuotteet lääkelainsäädännön alaisia (2001/83/EC) • Vaadittavat karakterisoinnit • Identity • Purity • Impurities • Biological activity/potency • Viability • Tumorigenicity • Ongelmana karakterisointien suoritus • Suositukset/ohjeet perustuu synteettisten lääkeaineiden testaukseen • Solujen elävä muoto ja kompleksisuus tuo ongelmia • Monimutkaiset tuotteet: solut ja scaffold • GMP taso

4. Identity • Solujen fenotyyppi ja/tai genotyyppi täytyy osoittaa • Fenotyyppi • Pinta-antigeenit, biokemiallinen aktiivisuus, kyky tuottaa tiettyjä biologisesti aktiivisia tai muuten mitattavia molekyylejä, morphologia etc. • Ei-solumateriaali • Scaffoldit, membraanit etc. • Rakenne ja koostumus määritettävä

5. Purity • Yleensä soluterapiatuote sisältää vain yhdentyyppisiä soluja • Halutaan päästä eroon muista solutyypeistä tai eri erilaistumisasteessa olevista soluista • Täytyy pystyä osoittamaan solutuotteen puhtaus • Jos sisältää muita solutyyppejä niin niiden osuus lopullisessa tuotteessa pitää pystyä osoittaan • Acceptance crteria = pitää asettaa raja minkä alla olevat vierassolumäärät eivät aiheuta riskiä/heikennä tuotteen toimintaa

6. Impurities • Tuotteeseen/prosessiin liittyvät epäpuhtaudet • Esim. Eläinperäiset materiaalit • Naudan Seerumi • Feeder-solut • Mahdolliset mikrobiset kontaminaatiot • Lista testattavista mikrobeista!! • Ihmiselle vaaralliset kemikaalit/reagenssit • Huomioitava myös hajoamistuotteet • Esim scaffolds • Kaikille epäpuhtauksille asetettava hyväksymiskriteerit (acceptance criteria)

7. Viability • Täytyy osoittaa kokonaissolumäärä sekä kuolleiden solujen osuus • Esim. 10 milj. solua, viabiliteetti 99 % • Käytettäviä menetelmiä • Propidium Iodide • Tryban blue • Molemmat erottavat kuolleen solun elävästä perustuen solukalvon eheyteen • Tarvittaisiin menetelmiä joilla pystyttyttäisiin tunnistamaan solut jotka ovat menossa kohti kuolemaa (varhainen apoptoosi) • Mitokondrion toiminnan mittaaminen?

8. Potency • = is the quantitative measure of biological activity based on the attribute of the product, which is linked to the relevant biological properties. The assay demonstrating the biological activity should be based on the intended biological effect which should ideally be related to the clinical response (ICH guideline 6QB).

9. Potency • Voi olla joko in vitro soluviljelyyn perustuva testi tai in vivo eläinmalli • Potensitestin lisäksi tärkeimpiä solun toimintoja on mitattava/seurattava tuotannnon aikana/ennen jakelua: • Viability, self-renewal, apoptoosi ja erilaistuminen • Vaikuttavat tuotteen tehokkuuteen • Käytettävät menetelmät: • Geeniekspressio profiilit, mikroarrayt, virtaussytometri, PCR jne. • Eri tuotteille oma räätälöity potency assay

10. Potency • Kaikkein vaikein kriteeri täyttää, koska monissa tapauksissa ei tiedetä mikä solun toiminassa aiheuttaa parantavan vaikutuksen • Mitä pitäisi mitata? • Ohjeistoja: • Potency testing of cell-based immunotherapy medicinal products for the treatment of cancer • Mahdollista osoittaa solutuotteen potency myös epäsuorasti/välillisesti • Mitataan jotain muuta ominaisuutta joka suoraan korreloi solun haluttua toimintaa • Täytyy pystyä osoittaan • Esim. mitokondrion toiminnan mittaaminen joka korreloi suoraan mesejen erilaistumis- ja invaasioaktiivisuuksiin • Merkittäviä toimintoja joita kantasoluilta vaaditaan

11. Potency • Mahdollisia mitattavia ominaisuuksia: • Biologiselle toiminnalle relevanttien markkerien ekspression mittaaminen • Pintamarkkerit • CD200 immunosuppressiivisiin sovellutuksiin • Erilaistumistehokkuus • Testi täytyy olla validoitu ja kvantifioitu standardeja vastaan

12. Tumorigenicity • Eroaa perinteisistä synteettisistä lääkkeistä, koska myös itse tuote voi transformoitua • Mahdollinen solujen transformaatio täytyy pystyä arvioimaan mittaamalla: • Proliferaatiota • Apoptoosivastetta • Genomista stabilisuutta/eheyttä

13. Solutuotteiden Karakterisointi

14. Endogenous microbe Personnel Culture materials Surgical infection Prion Environm. Personnel Equipm. Infection from donor Insufficient hygiene during cell harvest Contamination during cell manipulation Insufficient hygiene during cell transfer Solutuotteiden Karakterisointi

15. Solutuotteiden Karakterisointi: Laatukriteerit

16. Solujen mitokondrion kunnon mittaaminen: laatumittari? Olkiluodon Ydinvoimala

17. Mitokondrio • Solun voimalaitos • Toimintoja • Energian tuotto • Crebsin sykli • hengitysketju • Rasvahappojen hajoitus • Solun sisäisen Ca2+ tason säätely • Apoptoosin säätely • Rakenne • Ulko- ja sisäkalvo (kalvojen välinen tila) • Matriksi (sisätila) • Kristat • Oma DNA ja proteiinisynteesikoneisto Ulko – ja sisäkalvo Krista matriksi

18. Mitokondrio • Mitokondrion sisäkalvopotentiaali (DYm) • Hengitysketju sijaitsee sisäkalvolla • Koostuu viidestä kompleksista • 4+ F0F1 ATP syntaasi • Elektronin siirtäjät (NADPH) kuljettavat elektronit hengitysketjuun • Elektronit siirtyy kompleksista toiseen hapetuspelkistyreaktioiden kautta • Protoneita pumpataan kalvojen välitilaan • Syntyy gradientti (kalvopotentiaali) • ATP-syntaasin kautta protonit siirtyy gradienttiä vastaan  energiaa ATP:n muodossa

19. Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells • Measurement of mitochondrial function • Inner mitochondrial membrane potential (DYm) • Published in Tissue Engineering Journal:Pietilä et al. Vol15:2009 • Very sensitive for cellular stress • Distinguishes four different cell populations with different viability • Correlates with cellular function • Validated with hMSCs • Proliferation (MTT), Invasion efficiency, differentiation efficiency • Rapid to execute, results within a same day (Compare to MTT which takes days to weeks) • Flow cytometry based method allows a great amount of cells to analyse from one sample (10 000 – 50 000 cells)  reliable results • Analysing of membrane organization and integrity • AnnexinV: also early apoptosis indicator • Propidium Iodide

20. R2 R1 R3 R1 R2 R4 R3 R4 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells R1: Viable, functional cells R2: Very early apoptotic, quiescence cells R3: Early apoptotic, late apoptotic R4: Late apoptotic, necrotic cells

21. Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells

22. Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells 0h 20 mM Menadione - known oxidative stress inducer 4h 6h

23. Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells Mitokondrion kunnon mittaaminen ja osteogeeninen erilaistumistehokkuus

24. Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells Mitokondrion kunnon mittaaminen ja Invaasiotehokkuus (MatriGel)

25. Invasion efficiency 0-2,5 % ALP 1,0 U/mg prot Ca2+ 0,7 mM Invasion efficiency 2,5 % ALP 1,5 U/mg prot Ca2+ 1,9 mM Invasion efficiency 4,3 % ALP 2,4 U/mg prot Ca2+ 1,9 mM Invasion efficiency 6,5 % ALP 2,6 U/mg prot Ca2+ 2,2 mM Average Quality Good Cells Excellent Cells Bad Cells Cell therapy products for patients 2 8 0 6 4 JC-1 Aggregates/JC-1 Monomers Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells

26. Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells • Sovellutuksia: • Tulevaisuuden soluterapiatuotteiden karakterisointiin • Viability • Potency? • Tuotteiden tehokkuus ja turvallisuus • Kliinisiin kokeisiin • Taataan solutuotteiden toimivuus  tulokset vertailukelpoisia • Lääketeollisuuteen in vitro toksikologisuustesteihin • Kandidaatti lääkemolekyylien non-kliininen testaus • Varhaisen vaiheen testaaminen