Diagnóstico das Leucemias na Infância

1. Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM Diagnóstico das Leucemias na Infância Dra. Maria Lúcia de Martino Lee

2. EHRLICH - 1877 NEUTRÓFILOS Desenvolvimento das Técnicas de Coloração   BASÓFILOS  ACIDÓFILOS ( Eo) Descrição morfológica das leucemias

3. AVANÇOS TECNOLÓGICOS Técnicas convencionais: morfologia e citoquímica Imunofenótipo Citogenética convencional Genética molecular. Expressão genética/proteica. SÉCULO XX  Reconhecimento da heterogenecidade das leucemias

5. Reconhecimento subgrupos biologicamente homogeneos Identificação fatores prognósticos Delineamento de tratamentos mais específicos SECULO XXI

6. Diagnóstico e Classificação • Diagnóstico + classificação precisos= Essenciais para o estudo biológico e o sucesso terapêutico das leucemias infantis; • Sistema de classificação ideal deve ser biologicamente relevante; • Deve ser útil tanto ao onco-hematologista clínico, quanto ao pesquisador; • Deve ser reproduzível e amplamente utilizável.

7. Sangue Periférico Mielograma Morfológico Citoquímica Imunofenotipagem Citogenética/ Genética Molecular POX/SB FAB Linhagem Sub-linhagem PAS Alterações: - estruturais - numéricas Esterases Diagnóstico das Leucemias

8. Infiltração MO Tu Aplasia Medular Anemia Meg Leucemias SMD PTI SHF HIV S.ChediakHigashi Calazar Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica

9. Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica • Aspiração seca: a avaliação será enfocada apenas no SP e no estudo histológico da BIÓPSIA de MO. • Cerca de 20 % dos pacientes com leucemia não apresentam blastos circulantes ao diagnóstico.

10. Diagnóstico e Classificação das Leucemias AGUDAS • Representam 95 % das leucemias infantis • Proliferação de células imaturas: BLASTOS. • Sua enumeração na MO é fundamental para a definição diagnóstica de leucemia aguda. CRÔNICAS • Representam 3 a 5 % casos das leucemias infantis. • Proliferação de células relativamente bem diferenciadas.

11. Avaliação Morfológica/Citoquímica • Introduzidas na década de 60, algumas colorações citoquímicas (MPO, SBB, NSE) auxiliam na definição da linhagem e no diagnóstico de alguns subtipos de LMA.

12. Mieloperoxidase (MPO) • Cora os grânulos primários dos precurssores granulocíticos e menos intensivamente dos monócitos. • Ainda é considerada a reação “gold standard” para a diferenciação morfológica entre blastos linfóides (negativos) e mielóides (positivos).

13. MPO

14. Negro de Sudan (SBB) • Coloração não enzimática dos fosfolipídeos das membranas dos grânulos. Interpretação de positividade paralela a MPO, porém mais intensa.

15. Esterases não Específicas (NSE): Esterases não específicas (NSE): • alfa naftil acetato ( ANA ) esterase • alfa naftil butirato (ANB) esterase • Cruciais para a determinação de monoblastos/monócitos. É descrita em escala de 0 a + 4, e somente em níveis +3 ou +4 é caracterizado o blasto como monocítico. • Monócitos maduros reagem menos intensamente que monoblastos.

16. ANB esterase

17. PAS • Demais (PAS, Esterase Específica - CAE), Fosfatase Ácida, Ferro Medular): são atualmente de limitado valor diagnóstico.

18. Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica Linfóides: • Representam 80 % das leucemias infantis. • Caracterizam -se pela presença na MO de >25 % de blastos de características linfóides. MIelóides: • Representam 20% das leucemias infantis. • Blastos constituem no mínimo 30% do total das cels nucleadas ou não eritróides da MO ou mais de 20% de acordo OMS.

19. Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica Classificação FAB (1976): • Primeira a unificar a classificação das leucemias • Permitiu a comparação entre diferentes protocolos terapêuticos • Atualmente,ainda é a base citomorfológica para a classificação das LMA e SMD.

20. (L1, L2, L3) (M1 – M6) 1985 (M7) (RA, RARS, AREB, AREBt, LMMC) Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica FAB LLA LMA SMD

21. Outras classificações Classificação MIC (1986): • Classificação das LLA e posteriormente das LMA. • Baseia-se em critérios morfológicos, imunológicos e citogenéticos. Classificação da OMS (2001): • Inclui achados morfológicos/citoquímicos, além de características imunofenotípicas, genéticas e clínicas específicas.

22. L1 L2 L3 Classificação Morfológica FAB LLA

23. Classificação Morfológica FAB - LLA

24. a/b M4Eo M3v Classificação Morfológica FAB - LMA

25. LMA - M0

26. LMA – M1

27. LMA – M2

28. LMA - M2

29. LMA - M3v

30. LMA – M4Eo

31. LMA – M5

32. LMA – M6

33. LMA – M7

34. 2 4 2 10 22 25 25 10 Proporção aproximada de casos LMA na infância por subtipos

35. Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM Imunofenotipagem das Leucemias Agudas Dra. Maria Lúcia de Martino Lee

36. Diagnóstico das LA Definir linhagem/ sublinhagem celular (mieloides,linfoidesB, linfoides T, NK) Definir estágio maturativo do blasto Detecção DRM Futuro Desenvolver e monitorar novas terapias alvo(enzimas de superfície, moléculas de adesão, receptores de citocinas Imunofenotipagem das leucemias agudas (LA)Principais finalidades

37. Citometria de Fluxo Metodologia Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

38. Citometria de Fluxo Metodologia Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

39. Citometria de Fluxo Vantagens do método • Mede múltiplos parametros em células individuais • Grande número de células analisadas com rapidez • Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos • Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares

40. Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

41. Imunofenótipo da LLA Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

42. Desenvolvimento da linhagem mielóide Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

43. ImunofenotipagemTriagem Inicial – Painel de Marcadores

44. Classificação Imunológica das LLA Infantis MLL,t(4;11) TEL-AML, Hiperdiploidia t(1;19) t(8;14) Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

45. Classificação Imunológica da LLA T Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

46. Marcadores positivos CD 3c, CD 7 CD5, CD2, tdt CD10 (45 %) CD45 Marcadores positivos/negativos CD19, CD 13, CD33 Marcadores negativos CD79a MPO CD1a, CD3, CD4, CD8 <45 % casos Subdividida 3 estágios maturativos: Dificíl correlação prognóstica Classificação Imunológica da LLA T

47. CD10 CD19 CD22cy tdt CD79 LLA com co-expressão de antígenos mielóides • Crianças: 4 -35 % • Sem valor prognóstico independente CD33 (25%) CD13 (23%) CD15 (16%) CD14 (16%)

48. Imunofenotipagem na LMA Essencial: • LMA -MO • LMA - M7 Auxiliar: • LMA -M6 • LMA - M3 • LMA - 2 v • LMA -M4Eo • LMA - M5

49. Marcadores negativos MPO CD3c CD 79a c CD 22 c --------------------------- CD34,38,HLA-dr, tdt 1/3 dos casos ---------------------- CD 11b,15, as vezes CD2,7,19 fracos Imunofenotipagem das LMAs LMA minimamente diferenciada Marcadores positivos CD 13 CD 33 CD 117

50. Leucemia Megacarioblástica Aguda Marcadores Positivos • Plaquetários: • CD 41, CD 42,CD 61 Marcadores Negativos ou Positivos: • Mielóides: • CD13 +, CD 33+,CD 117+ Marcadores Negativos: • anti MPO, CD 34, CD 45,HLA - DR