E N D
1. 1
2. 2 Cosa si intende per trasformazione ?
In biologia molecolare la trasformazione la replicazione di DNA estraneo in una cellula batterica.
3. 3
4. 4 Escherichia Coli Regno:Bacteria
Phylum:Proteobacteria
Classe:Proteobacteria Gamma
Ordine:Enterobacteriales
Famiglia:Enterobacteriaceae
Genere:Escherichia
Specie:E. coli
5. 5
6. 6
7. 7 Metodi di trasformazione
8. 8
9. 9
10. 10
11. 11
12. 12 Metodi fisici Shock termico:
Vengono utilizzate cellule di E. Coli rese competenti tramite un trattamento chimico che permette di rendere labili le pareti cellulari.
I batteri sono posti a contatto con il plasmide di interesse e lasciati in ghiaccio per 30 minuti.
In questo periodo di tempo il DNA aderisce alla membrana cellulare.
13. 13 Successivamente le cellule vengono poste in un bagnetto a 37 o 42C (a seconda del ceppo batterico utilizzato) per 30 secondi. In questa fase le membrane formano dei pori e possono assorbire il DNA nudo.I batteri sono rimessi in ghiaccio per 2 minuti.Viene aggiunto il terreno di coltura (generalmente LB) e messi sulla ruota allinterno dellincubatore a 37C per unora.
14. 14 Metodi fisici Elettroporazione:
Elettroporatore
ECM 830
15. 15 Le cellule sono poste in una soluzione contenente DNA e soggette a un breve impulso elettrico che produce transitoriamente lapertura di pori nelle loro membrane.
Attraverso i pori il DNA entra direttamente nel citoplasma.
Poich le cellule di E.Coli sono piccole richiedono campi elettrici molto elevati per lelettroporazione, rispetto a quelli usati per introdurre il DNA nelle cellule eucariotiche.
16. 16
La pi alta efficienza di trasformazione si ottiene quando la concentrazione di DNA elevata.
Lelettroporazione temperatura dipendente e la migliore si ottiene a 0-4C.
17. 17
18. 18 Lefficienza di trasformazione tramite elettroporazione influenzata da numerosi fattori:
La potenza del campo elettrico applicato:a basso voltaggio le membrane plasmatiche non sono sufficientemente alterate per permettere il passaggio del DNA, a elevato voltaggio le cellule sono irreversibilmente danneggiate.
Lampiezza dellimpulso elettrico.
La temperatura.
Concentrazione del DNA.
Composizione ionica del mezzo.
19. 19 Microiniezione
20. 20
21. 21
22. 22 Metodi chimici Trasformazione con cloruro di calcio:
Tutti i metodi chimici si basano sullosservazione che batteri trattati con soluzioni fredde di ioni bivalenti lasciano entrare DNA nudo in modo pi efficiente. Si ipotizza che laggiunta di ioni bivalenti (Ca++), mascherando le cariche negative del DNA, ne favorisca lingresso nella cellula di E. coli.
23. 23
24. 24
25. 25
26. 26
27. 27 Metodo di Hanahan
Il microbiologo americano Douglas Hanahan ha creato molti dei ceppi di E. coli di uso comune (es. DH5a, DH10B).
Il metodo da lui sviluppato usa una soluzione trasformante ottenuta misurando laumento di efficienza di una soluzione base cui venivano aggiunti uno alla volta diversi componenti.
28. 28
29. 29
30. 30 Metodi biologici Lipofezione:
Il DNA pu essere
incorporato entro
vescicole lipidiche
artificiali dette liposomi.
31. 31
32. 32
33. 33
34. 34