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1. POTENCIAL BIOFERTILIZANTE DE BACTERIAS DIAZÓTROFAS AISLADAS DE MUESTRAS DE SUELO RIZOSFÉRICO AUTOR: AUTOR: Laura Y. Moreno y Galvis INTEGRANTES • DIEGO FERNANDO REYNOSO MAMANI • JORVICH OLANO TRUJILLO DOCENTE:Dr. HEBERT H.SOTO GONZALES CURSO:BIOTECNOLOGIA

2. POTENCIAL BIOFERTILIZANTE DE BACTERIAS DIAZOTROFAS AISLADAS DE MUESTRAS DE SUELO RIZOSFERICO METODOS Y MATERIALES METODOS Y MATERIALES INTRODUCCION Las bacterias de vida libre, o en simbiosis, que habitan la rizosfera pueden estimular el crecimiento de las plantas a través de diferentes procesos, como la síntesis de reguladores del crecimiento vegetal, la fijación de nitrógeno, la solubilización de nutrientes, la producción de sideróforos y el control de fitopatógenos del suelo . 1. Identificación con el uso de medios selectivos y pruebas bioquímicas 1.RECOLECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS MUESTRAS DE SUELO El análisis de las muestras de suelo rizosférico mostró un pH(5,1) y (7,8); promedios de: materia orgánica 7,12 %; fósforo 262,5 ppm; potasio 0,58 meq/100 g; calcio 17,6 meq/100 g y magnesio 2,1 meq/100 g; y textura franca y franco-arenosa. se tomaron de suelos rizosféricos de 16 sitios diferentes, con cultivos de pastos, café, caña de azúcar, maíz y frutales; estos se ubican en el municipio de Chinácota, Norte de Santander, Colombia un análisis dela materia seca; se determinó el pH, el fósforo, el potasio, el calcio y el magnesio. ORGANISMOS ESTUDIADOS 2.AISLAMIENTO MEDIANTE MEDIOS SELECTIVOS transforman el nitrógeno atmosférico en amonio (proceso conocido como fijación biológica de nitrógeno) para que pueda ser incorporado a la biosfera. Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas y Bacillus Stenotrophomonas, Klebsiella, 2.AISLAMIENTO MEDIANTE MEDIOS SELECTIVOS Beijerinckia, 32 aislados puros, los cuales se correspondieron con bacterias fijadoras de nitrógeno. El análisis con el sistema BBL CRYSTAL permitió identificar Klebsiella ozaenae, Klebsiella oxytoca o Serratia rubidea, K. oxytoca o K. pneumoniae, K. pneumoniae, maltophilia, Aeromonas hydrophila o Enterobacter sakazakii, E. cloacae o E. sakazakii, E. cepacia o Pseudomonas fluorescens y Serratia fonticula.s pneumoniae subesp. IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS NATIVOS mediante los medios Winogradsky y Agar Ashby. las características macroscópicas y microscópicas de los aislados puros. Para la clasificación de los aislados nomenclatura: aislado M3-1. K. oxytoca, S. se utilizó la siguiente Estos crecimiento vegetal , Azotobacter vinelandii, Stenotrophomonas Burkholderia cepacia estos se presentan mayormente en el campo y así poder evaluar su el biofertilizante. microorganismos promueven el cloacae, B. cepacia, B. maltophilia y 4.IDENTIFICACIÓN MOLECULAR 3.CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA MEDIANTE BBL CRYSTAL El análisis molecular de A. vinelandii mediante PCR, con la utilización de los cebadores nifH-g1-for y niH-g1-rev (fig. 1a), se observó una banda de 370 pb en el aislado M8-4, que es una amplificación adecuada según señalan Bürgmann et al. (2003) y Levy-Booth y Winder (2010). maltophilia, los cebadores SM1-for y SM4-rev reconocieron los aislamientos M1, M2, M4-1, M6-3, M8-3, M8-9, M8-10, M10-1 y M11-3 (fig. 1b), y amplificaron una banda de 531 pb, que se corresponde con lo planteado por Whitby et al. (2000) y Kiskova et al. (2012) (fig. 1b). La amplificación con el uso de los cebadores G1c-for y G2c-rev cepacia no mostró resultados, lo que posiblemente se debió a que ninguno de los aislamientos analizados molecularmente correspondía a esta. El análisis de los cebadores G1c-for y G2c- rev realizado en BLAST mostró una alta especificidad para el género Burkholderia, ya que reconoció las especies B. cepacia, B. cenocepacia y B. ambifaria. TECNICAS CONVENCIONALES El sistema de identificación incluye pruebas para la fermentación, la oxidación, la degradación y la hidrólisis de diversos sustratos. En la identificación de S. propiedades descripción coloración Gram, el análisis de su capacidad para crecer en condiciones aerobias o anaerobias, o el análisis de requerimientos especiales para su cultivo; permiten su identificación hasta género bioquímicas, de su tales como: celular, la la morfología caracterización serovariedades o cepas, se precisa de técnicas más sensibles y específicas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que identifica una secuencia única en el ADN. de especies, subespecies, 4.IDENTIFICACIÓN MOLECULAR de estas sustratos técnicas se utilizó el UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit de MoBio. En la identificación molecular se emplearon los cebadores específicos. para la identificación de B. CONDICIONES EL OBJETIVO A IDENTIFICAR consistio en una desnaturalización inicial a 95°C por cinco minutos, seguida de 30 ciclos de 95°C por un minuto, 60°C por 30 segundos y 72°C por un minuto; y una extensión final a 72°C por 7 minutos. Los productos de la PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1 % y teñidos con bromuro de etidio. identificar, Enteric/Nonfermenter microorganismos diazótrofos aislados a partir de muestras de suelo rizosférico en cultivos. mediante BBL Kit Crystal™ y 5.EFECTO BIOFERTILIZANTE ID PCR, Los mejores resultados en la emergencia de las plantas, el diámetro del tallo y la longitud de las hojas y los tallos fueron M8-10, M10-1 y M11-3, identificados como S. maltophilia por PCR. Estos tuvieron diferencias significativas con respecto al testigo y a la fertilización química, además se observó una mayor eficiencia en la emergencia y el crecimiento en las plantas de maíz. El tratamiento con M10-1 mostró una mayor eficiencia en el desarrollo de la planta, rápida emergencia y un mayor tamaño en el diámetro del tallo, longitud de las raíces y los tallos, así como un mayor peso seco (fig. 2). M10-1 presentó valores por encima de la media y límite superior, con respecto a los otros aislados y controles 5.EFECTO BIOFERTILIZANTE Se realizó un ensayo en invernadero con plantas de maíz para evaluar el porcentaje de emergencia de estas, el diámetro del tallo y la longitud de las hojas y de los tallos; se comparó el efecto de seis aislados identificados por PCR (M-1, M8-4, M8-9, M8-10, M10- 1 y M11-3).para la parte estadística se eligio muestra al azar y con ANOVA.