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La Recombinaison homologue. La recombinaison g
E N D
1. Transmission dinformation gntique La Transmission horizontale : Elle est unidirectionnelle et passe souvent par la recombinaison homologue.
Les 3 moyens d'change gntique pratiqus par les procaryotes (transformation, conjugaison et transduction) font appel la recombinaison homologue.
La recombinaison homologue chez les eucaryotes se manifeste principalement au cours dune division particulire, la miose, chez les bactries celle-ci peut avoir lieu tout le long du cycle cellulaire.
La comprhension de la recombinaison homologue est essentiellement base sur les travaux effectus chez E. coli.
2. La Recombinaison homologue La recombinaison gntique est le concept de base utilis pour la localisation de mutations (et par extension de gnes).
Cassure et jonction de nouvelles squences sont en partie responsables de la diversit gntique observe chez les procaryotes.
Ex. : A--B et a--b donne A--b et a--B aprs recombinaison.
La recombinaison homologue seffectue entre squences dADN identiques ou quasi identiques dont la longueur dhomologie chez E. coli peut tre aussi courte quune 30aine de pb.
Elle requiert la mobilisation de produits de nombreux gnes pour rsoudre ce que vous connaissez sous le terme de crossing-over.
3. La Recombinaison homologue, les tapes Cassure dADN
Recherche dhomologie et initiation dappariement, tape cl gre par le produit du gne recA
Modle des jonctions de Holliday
Migration des jonctions de Holliday, extension de la zone de recombinaison
Rsolution
Les intervenants protiques sont extrmement nombreux chaque tape et cest la coordination de tous les vnements qui aboutit lchange gntique.
Les mcanismes de recombinaison homologue sont la fois responsables du maintien de linformation gntique (outils de rparation) et sources de variation de linformation.
4. Modle de recombinaison homologueIllustration: KowalczykowskiTIBS 25 april 2000, p156
5. La Transformation Processus permettant la capture dADN exogne nu par une bactrie et son incorporation au gnome de celle-ci.
6. La transformation : ex, le pneumocoque La bactrie Streptococcus pneumoniae : Diplocoque Gram positif
Niche: Nasopharynx chez l'homme, 1 individu sur 2 est porteur sain
Pathogne, provoque principalement des pneumonies, des otites, mningites...
Reprsente aux USA environ 500000 hospitalisations et 40000 dcs,
en France environ 10000 dcs. 1re cause de mortalit par infection chez lenfant, 1re cause de mningite et de surdit acquise chez lenfant
Cibles privilgies : enfants, personnes ages et individus ayant leur systme immunitaire affaibli (un fumeur aurait un risque augment d'un facteur 4)
7. La transformation : ex, le pneumocoque
Particularits : Possde une capsule polysacharidique le protgeant du systme immunitaire avec une variabilit importante, environ 90 srotypes rpertoris.
Capable de capturer de l'information gntique exogne via un systme gntique programm qu'est la Transformation gntique naturelle. De ce fait, cette bactrie possde une grande plasticit gntique.
La transformation est la base de l'mergeance rapide de clones rsistants aux antibiotiques
8. tapes de la transformation
9. tapes de la transformation
10. Entre de LADN, aspect Mcanistique
11. Approche exprimentale Comment la bactrie sapproprie-t-elle linformation exogne?
Y a-t-il change physique par recombinaison homologue ou bien l'information est-elle recopie sur le gnome sans incorporation de la molcule exogne?
Vincent Mjean and Jean Pierre Claverys; J. Bacteriol. 1984; Vol 158; N3; 1175-1178
Mise en Place de l'exprimentation
- plasmide pR6 d'E. coli contenant un fragment d'ADN PstI/EcoRI chromosomique de Sp de 5.7 kpb.
12. Suivi du devenir de lADN :stratgie exprimentale
13. Vincent Mjean and Jean Pierre Claverys; J. Bacteriol. 1984; Vol 158; N3; 1175-1178 Profil de radioactivit aprs Southern
14. Devenir de lADN internalis
15. Suivi de lADN
16. Suivi du devenir de lADN :stratgie exprimentale
17. Sous quelle forme lADN entre dans la bactrie ?
18. Polarit dentre Existe-t-il une polarit d'entre de l'ADN simple brin, comment l'observer ?
Vincent Mjean and Jean Pierre Claverys Mol. Gen. Genet. 1988; 213, 444-448
Exprimentation
Utilisation du bactriophage M13, polymrase, dNTP radioactifs et froids, enzyme de restriction et purification des molcules dsires. Obtention de diffrents substrats
19. Polarit dentre
20. Recombinaison RecA dpendante Martin,B.; Ruellan,J.M.; Angulo,J.F.; Devoret,R.; Claverys,J.P. 1992 Nucl.Acids Res. 20 6412
Martin,B.; Garcia,P.; Castani,M.P.; Claverys,J.P.1995 Mol.Microbiol.15 367-379
Question: par quel mcanisme cet ADN simple brin est-il recombin dans le gnome? Est-ce qu'il existe un systme de recombinaison homologue recA dpendant similaire celui de E.coli?
Mise en place de la recherche d'un quivalent de RecA d'E.coli.
Isolement d'un gne homologue par recherche anticorps croise.
Quel est le comportement d'un mutant recA nul en transformation?
Ne transforme pas
21. Recombinaison RecA dpendante Question: ne rentre pas ou bien ne recombine pas?
Exprimentation:
ADN donneur radioactif + cellule comptente en parallle sur wt et recA
Rsultats interprtations:
Mesure de l'entre en radioactivit
Dpm/bactries 3.3 10-4 pour wt et 3.5 10-4 pour recA
Mesure du taux de transformants Smr chromosomique
1.8 106/ml (3%) et <10/ml pour recA
Dans le mutant recA, l'ADN entre comme dans le wt, recA est donc impliqu dans la dernire partie de la transformation, la recombinaison homologue.
22. La conjugaison Une remarquable proprit de bien des plasmides est de possder linformation gntique leur permettant de se transfrer dune cellule lautre : cest la conjugaison.
Observe pour la 1re fois en 1947 par Lederberg et Tatum chez E. coli.
La conjugaison est un mcanisme unidirectionnel avec une bactrie donneuse et une bactrie rceptrice.
Parfois les plasmides conjugatifs participent la mobilisation du chromosome ou dautres plasmides.
Les plasmides conjugatifs peuvent tre classs selon leur mode de rplication (groupe dincompatibilit) et aussi selon leur mcanisme de transfert (gnes tra).
Beaucoup de plasmides dits large spectre dhte sont capables dtablir des transferts inter-espces mais aussi inter-royaumes.
23. Mcanisme de conjugaison Cf petit film
2 tapes importantes: rplication de linformation et transport de lADN.
Contact cell-cell : ensemble de protines constituant un systme de scrtion de type IV chez les Gram- formant un canal trans-membranaire.
Le complexe ADN-protine charg de la rplication :
Cassure simple brin au niveau doriT (diffrent de oriP)
Dplacement par une hlicase du brin cass
Passage dans la cellule rceptrice et recircularisation du brin
Synthse des brins complmentaires.
24. Transfert du chromosome par conjugaison Cf petit film
Formation dHfr ( linsertion du facteur F : recombinaison homologue entre IS et formation de cointgrat via des vnements de transposition).
Un chromosome peut tre aussi mobilis si celui-ci possde une oriT.
Facteur prime: insertion dADN chromosomique dans le plasmide conjugatif
(ex: partir dun Hfr, une recombinaison homologue peut avoir lieu entre 2 IS rptes directement entourant linsertion du F, donnant ainsi un F)
Ces vnements jouent un rle certain dans lvolution puisque des gnes peuvent tre changs entre espces loignes
Historique: E. coli
Les outilsgntiques drivs du mcanisme:
La cartographie gnome circulaire
Le Mating out
25. Dtermination gntique de la transmissibilit dun plasmide Pour observer un transfert il faut liminer les donatrices et les rceptrices pour ne conserver que les rceptrices ayant reues le plasmide.
Contre-slection de la rceptrice : il faut que le plasmide possde un marqueur de slection que na pas la rceptrice. Si le Plasmide ne possde pas un gne slectionnable, il faut en introduire un.
Contre-slection de la donatrice: il faut que la rceptrice possde un marqueur de slection que na pas la donatrice (ex: une rsistance chromosomique).
Choix de la cellule rceptrice crucial: proche de la donatrice pour viter des problmes de restriction, de rplication du plasmide et dexpression du gne de slection.
La manipulation consiste taler la donatrice, le mlange, et la rceptrice, seul le mlange devrait donner des colonies sur milieu double slection.
26. La conjugaison chez Enterococcus faecalis : un exemple de communication bactrienne G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539
Cela fait bientt 30 ans que lon a isol le plasmide conjugatif pCF10 confrant la rsistance la ttracycline chez E. faecalis.
Isol partir dune infection nosocomiale, il a t nouveau isol du mme hpital mais cette fois avec une rsistance la vancomycine, un des derniers antibiotiques rempart contre les bactries pathognes ou opportunistes.
Cela signifie que ce plasmide a voyag parmi les entrocoques acqurant diffrents Transposons responsables de ces nouvelles rsistances.
27. La conjugaison chez Enterococcus faecalis : un exemple de communication bactrienne G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539
28. Comment la cellule rprime linduction de cCF10 ?G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539
29. Synthse de la phromone cCF10 G. Dunny M Antipora et H Hirt mars 2001 Peptides 22 1529-1539
30. Conjugaison chez les Streptomyces
31. Transposon conjugatif ou ICEBurrus, Pavolovic, Decaris et Gudon molecular Microbiol. 2002 vol 46 p601-610 Hybride entre les transposons recombinaison spcifique de site et plasmide conjugatif dpourvu doriP.
Le plus connu est Tn916 isol aussi chez E. faecalis. Ces lments sont actuellement rpertoris et semblent trs rpandus dans le monde bactriens.
Appels ICEs pour Integrative and Conjugative Elements. La trs grande majorit dentre eux font tous appel un systme de recombinaison site spcifique pour leur intgration.
Note: pCF10 doit sa rsistance la ttracycline par lintgration de Tn925 qui est un ICE dans le plasmide conjugatif dorigine..
32. Le monde des bactriophages
33. Le monde des bactriophagesEx: N. Mann, FEMS Microbiology review 27 (2003) p17 La place des bactriophages dans le monde vivant est prendre en compte.
Les cyanobactries comme Synechococcus et Prochlorococcus sont responsables de 32 89% de lapport oligotrophique dans les ocans et de 50% de loxygne que lon respire.
Ces bactries sont prsentes en moyenne 106/ ml deau de mer. Cependant on estime que les bactriophages sont 10 x plus nombreux.
Au cours de lanne la rpartition des cyanobactries dans une rgion, tant en profondeur quen quantit, varie normment et semble corrle la multiplication de certains bactriophages.
Ceux-ci possdent en plus de leur information gntique des gnes participent la photosynthse, pouvant ainsi influencer la survie de la population bactrienne
34. Les cycles
35. La transduction
36. La transduction La transduction est un phnomne rare et cela pour plusieurs raisons:
lerreur dempaquetage dans la capside est un vnement peu frquent.
La probabilit que cette particule infecte seule une bactrie rceptrice est faible
Cet ADN inject doit survivre suffisamment longtemps pour former un transductant stable (chapper aux endo et exonuclases, et sinstaller par recombinaison ou transposition ou par rplication autonome )
Quest ce qui fait quun phage peut tre transductant?
Il ne doit pas dgrader entirement lADN de lhte. Les motifs ADN dempaquetage ou sites Pac (Packing) ne doivent pas tre trop spcifiques.
37. La transduction
38. La transduction
39. La transduction : M.O.I.
40. La transduction de marqueur gntique
41. La transduction de marqueur gntique
42. Cartographie par cotransduction
43. Cartographie de 3 marqueurs par analyse des frquences de cotransduction.
44. Cartographie 3 marqueurs par frquence dvnements de recombinaison
45. La rgulation transcriptionnelle chez les bactries La transcription par lARN polymrase dune rgion dpend du motif de reconnaissance et de son accessibilit
46. La rgulation transcriptionnelle chez les bactries Evidence gntique de rgulation positive ou ngative.
47. La rgulation transcriptionnelle chez les bactries La complmentation rvle en gnral une diffrence supplmentaire pour les mutants constitutifs entre une rgulation positive et ngative
48. La rgulation ngative de l'opron lactose Si l'on fait pousser Escherichia coli dans un milieu contenant uniquement du lactose comme seule source de carbone et d'nergie, on voit que la bactrie produit une enzyme spcifique de l'utilisation de ce substrat : la b-galactosidase, alors que cette dernire n'est pas dtecte sur un milieu contenant une autre source d'nergie (de 0 1000 fois plus).
Ceci est galement vrai pour les autres substrats carbons tels que l'arabinose, etc.. except le plus simple "intgrer" dans les diffrents cycles nergtiques, le glucose.
Il existe une rponse adaptative de la bactrie.
La b-galactosidase n'tant induite qu'en prsence du lactose (inducteur).
49. Comment la bactrie peut-elle savoir prcisment quel enzyme synthtiser? F. Jacob et J. Monod ont obtenu deux type de mutants.
des mutants lac- dans la rgion ZY et aussi dans la rgion lacI
des mutants lac+ dans la rgion I qui avait pour caractristique d'tre constitutif (les gnes ZYA sont tout le temps exprims)
Ils ont montr que cette rgion I contrle l'inductibilit des gnes ZYA. Ce contrle ce fait par l'intermdiaire d'une protine I diffusible ayant la capacit de rprimer la transcription de ZYA.
50. Test de complmentation Notion de mrodiploide
51. Mutations lac- rcessives
52. Mutations lac- rcessives avec action en Cis Les mutations rcessives qui ne peuvent pas tre complmentes affectent en gnral un site ADN plutt quun produit de gne diffusible.
53. Mutations lac- dominantes
54. Mutations rcessives constitutives
55. Mutations dominantes constitutives avec action en trans