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Genoma Umano e malattie genetiche

Genoma Umano e malattie genetiche. lezione 5-6 Martedì 12 Aprile. cluster Ig topo-uomo. mta1. crip2. crip1. hole. a. e. g2 a. g2 b. g1. g3. d. m. J. D. V. Mouse Igh cluster Chromosome 12. Em. hs 1,2. hs 3A. mta1. trascrizione. hs 4. hs 3B. JDV. 12F1.

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Genoma Umano e malattie genetiche

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Presentation Transcript

  1. Genoma Umano e malattie genetiche lezione 5-6 Martedì 12 Aprile

  2. cluster Ig topo-uomo mta1 crip2 crip1 hole a e g2a g2b g1 g3 d m J D V Mouse Igh cluster Chromosome 12 Em hs 1,2 hs 3A mta1 trascrizione hs 4 hs 3B JDV 12F1 BAC199M11(AF450245) mta1 crip2 crip1 hole a2 e g4 g2 g a1 e g1 g3 d m J D V Human Igh cluster Chromosome 14 Em hs 1,2 hs 3 hs 1,2 hs 3 mta1 hs 4 hs 4 JDV 14q32.33 3’a2 3’a1 g hs4 hs1.2 hs3 20bp a1 elk 2.1 3’a1 86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,060,000 86,065,000 86,070,000 86,075,000 hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs3 a2 20bp 3’a2 85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500 centromero telomero (rischio riarrangiamenti) IgH3’RR-A IgH3’RR-B

  3. le regioni regolative delle Ig geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili * trascrizione regione duplicata regione duplicata reg. variab.* a2  4  2 1  1 3  V D J *  centromero 3 enhancers 3 enhancers enhancer 5’ IgH3’RR-B IgH3’RR-A Chromosome 14q32

  4. quante funzioni per la maturazione delle Ig ? metodo riduzionistico metodo olistico globale che approccio possiamo usare nel topo e quale nell’uomo ?

  5. metodo riduzionista la genomica permette studi globali ma come si possono studiare le regioni cis regolative ? si possono ottenere topi transgenici, ma uomini no si possono ottenere linee cellulari transgeniche anche umane il knock - out ed il knock - in sono molto usati

  6. mutanti umani a disposizione ? quali sono le mutazioni umane che si possono studiare ? a = polimorfismi b = patologie

  7. modello della regolazione delle Ig non ci sono due genomi uguali (a parte i gemelli omozigoti) infatti si trovano polimorfismi dovunque si cercano prima della conoscenza di tutto il genoma erano più rari perchè si cercavano solo sulle sequenze codificanti la nuova frontiera sta nelle sequenze regolative

  8. epigenetica nella oligarchia regolativa la gerarchia ha le sue eccezioni il sistema è bidirezionale e deve tener conto dell’ambiente i semi sono programmati ma senza interazione con l’ambiente non possono germinare esempio troppo banale

  9. altro esempio il sistema immunitario ha una sua programmazione ma il suo compito è deve proteggere dalle infezioni e deve essere reattivo all’ambiente quindi si tratta di gerarchia intelligente : modulabile

  10. modello Jacob-Monod fino da questo modello dellla regolazione del primo operone era chiara la necessità di interazione con l’ambiente per ambiente non si intende solo lo spazio esterno all’organismo ma anche intercellulare o citoplasmatico la cascata della regolazione ha a che fare con le modificazioni epigenetiche non è sempre chiaro chi regola chi

  11.  LCR locus control region (nel topo 4 enhancers)IgH3’RR-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus) LCR *HS = hyper sensitivity to DNase I *HS3A HS1,2 HS3B HS4 mouse Ig heavy locus V D J a   b   L C R human chromosome 14 q 32 HS3B HS1,2B HS4B HS3A HS1,2A HS4A 3’RR-A 3’RR-B   3 1  1 2 4  a2  centromero duplicazione 1 duplicazione 2

  12. contigs del sequenziamento genoma umano e precedenti Y14407 AL928765 U64453 X76785 AL928767 CHR77 (35.616 kb) Chromosome 14 IgH3’RR-A elk elk  4  2 1  1 2 3   centromero SF AL928742 (40 kb) IgH3’RR-B l contigs delle regioni IgH 3’RR

  13. IgH3’RR-A SA2.5 A2R Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 H* H B E B B B H B H H U 14 U9 1 R4 R6 Ua1 U3 U5 R3 R3r U5r Ua4 R5 Alu LTR ELK2 U1 R1 R2 U4 U6 U7 U8 U6r Ua2 Ua3 R5 U11 U12 U16 U13 K10 retrovirus U15 Ua5 U10 U2 A HS3 HS1,2 HS4 Y14407 AL928765 U64453 X76785 AL928767 CHR77 (35.616 kb) Chromosome 14  4  2 1  1 2 3 centromero   IgH3’RR-B B SF AL928742 (40 kb) Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 H H B B H B E B B H U9 Ub4 R6 Alu LTR 2 R1 U6r R4 Ub3 R5 Ub1 Ub2 R3 U 8r U5 U4-5 U 3 U13 U14 U15 U16 U2 U4 U7 U10 U11 U12 R3r R5 U1 U7r U5r R3 U6 HS3 HS1,2 HS4 SA2.5 A2R A2F

  14. synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4 TOR VERGATA Symergic effects HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (g2b, g3, a,e) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific manner. (Ong et al, 1998)

  15. Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’ enhancer HS1,2 and its relation to gene expression Immunology 2001, 103: 35-40

  16. le due 3’RR sono ridondanti TOR VERGATA se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ? 3 domande: è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ? nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si studiano male) - dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ? - hanno tempi di attivazione diversi? - si attivano e disattivano nelle fasi diverse della vita del linfocita B?

  17. come si possono studiare nell’uomo le 3’RRs perchè nell’uomo? il modello murino è parziale: una sola 3’RR in vitro in epidemiologia genetica in patologia

  18. Studio di correlazione dei polimorfismi Che cosa possiamo andare a studiare nella struttura La struttura regolatrice ha dei polimorfismi che coinvolgono la funzione in quanto variano i siti di legame dei fattori di trascrizione Ad ogni forma allelica può corrispondere una diversa funzione Studio della distribuzione degli alleli nelle diverse popolazioni Esistono frequenze alleliche diverse nelle popolazioni umane

  19. i polimorfismi H* H B B E E B B B B H 4420 bp Core of enhancer HS1,2 14bp 16bp 20bp A B Selective amplification of HS1,2-A downstream Ca1 (IgH3’EC-1) Selective amplification of HS1,2-B downstream Ca2 (IgH3’EC-2) Poly A site Poly A site B H B HS 3 HS 3 U8 r U7r R3 R3 R3r Ub2 U5 U1 R1 Ub1 R3 R3 r Ua1 U5 U8 U1 U3 2m U2 U6 U4-5 U6r U5r R4 U4 U6 U7 1m R1 R2 UU 3 4 HS 1,2 U2 HS 1,2 SA2.5 5402 bp HS1,2 HS 3 HS1,2 A2R SA2.5 A2R A2F EcoRI HS1,2 ALLELE 1A D3Rev P3Frw EcoRI ALLELE 2A EcoRI EcoRI HS1,2 ALLELE 3B ALLELE 3A P3Frw EcoRI EcoRI D3Rev ALLELE 4B ALLELE 4A Repeated element - 38 bp Internal spacers External element - 31 bp External element -17 bp Conserved sequence Unit

  20. gli alleli A M1 M2 G A B G A B G A B CM11 CM 4 CM 5 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 38bp Rp 17bp El. END HS1,2 17bp El. B 72 ALLELE 1A CORE enhancer ALLELE 2 ALLELE 3 ALLELE 4 ALLELE 1 14bp Sp. ALLELE 2A 114 16bp Sp. 178 ALLELE 3A 31bp El 20bp Sp. ALLELE 3B 198 ALLELE 4A 250 Sites for : AP4; E47; MYOD; mE5 Sites for : CMYB 250 ALLELE 4B Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50) Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-) Sites for : NF-kB (Q6)

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