1 / 99

L’Spliceosoma Introducció

L’Spliceosoma Introducció. 1. INTRODUCCIÓ GENERAL A L’SPLICING 2. APROXIMACIÓ ESTRUCTURAL A LES SUBUNITATS DE L’SPLICEOSOMA 3. APROXIMACIÓ A 3 DOMINIS ALTAMENT REPETITS: RS RRM Polar Zippers 4. BIBLIOGRAFIA. L’Spliceosoma. Expressió proteïnes. L’Spliceosoma Introducció mecanística.

asher
Télécharger la présentation

L’Spliceosoma Introducció

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. L’Spliceosoma Introducció

  2. 1. INTRODUCCIÓ GENERAL A L’SPLICING2. APROXIMACIÓ ESTRUCTURAL A LES SUBUNITATS DE L’SPLICEOSOMA3. APROXIMACIÓ A 3 DOMINIS ALTAMENT REPETITS:RSRRMPolar Zippers4. BIBLIOGRAFIA L’Spliceosoma

  3. Expressió proteïnes...

  4. L’Spliceosoma Introducció mecanística

  5. L’Spliceosoma Introducció mecanística

  6. L’Spliceosoma Introducció mecanística

  7. L’Spliceosoma Introducció mecanística

  8. L’Spliceosoma Introducció mecanística Molts passos Multitud de proteïnes i RNAs ATP DEPENENT! ATP ATP

  9. Aproximació estructural al Spliceosoma • Estructures extremadament grans • Nombroses proteïnes • Molt dinàmic

  10. U1 • Funció: Reconeix lloc 5’ i recluta altres unitats. • Imatge de criomicroscopia electrònica de 10Å • Proteïna de 240 KDa

  11. U1 components • snRNA de 165nt amb lloc Sm (AAUUUGUGG) • Unitat Sm (heteroheptàmer) • Proteïna U1A • Proteïna C • Proteïna 70K

  12. U1A • snRNP U1A • 31 Kda • Ressolució de 10 Å • Domini RRM (prot-RNA) Al SCOP Cl α+β Fold Ferrodoxin-like (α+β sandwitch with antiparalel β sheet = (β-α-β)*2 Sfam RNA binding domain Fam Canonical RBD Loop II de la snRNA U1

  13. Anell Sm • Repetit en diverses U (U1 U2 U4/6) • Només es disposava d’estructures de Rx per a quatre de les 7 subunitats i de una reconstrucció a partir de criomicrografia electrònica. 70-80Å

  14. SCOOP • Cl = all β • Fold = Sm-like fold (core: barrel open n*=4 s= 8 meander) • Sfam = Sm-like RNP Anell Sm (II) Construcció de les subunitats que falten mitjançant MODELLER i partint de les subunitats que sí que teníem (es a dir D1 D2 D3 i B). E B D1 F D3 D2 G

  15. Anell Sm Muntatge + D1, D2, B... Monòmer Xam!!! Homoheptàmer format per Sm-like protein (de cierta archea, de cuyo nombre no quiero acordarme) Alignment score Sc = 6.361942 Alignment length Lp = 107 RMS deviation after fitting on 35 atoms = 1.083019 Secondary structures are from DSSP

  16. Anell Sm Muntatge + SUPERPOSE.pl (Xam!)

  17. Anell Sm Muntatge 70-80Å

  18. Visió conjunta de U1 Sm U1 smRNA U1A 70 Kda + C

  19. U2 Components • Auxiliar factors = U2AF65 i U2AF35 • U2 SF3B • P14 – interacció branch site • SF3b 145, 49, 120, ...... Doblegen exó • SF1 interacció amb el branch site • U2 SF3A composat per: • U2B’’- U2A’ prot complex • Core Sm • snRNA U2

  20. U2AF = Auxiliar factors • Només una part te estructura per crsistalografia de Rx (2.2 Å) • U2B’’ • U2A’ • Tenen com a funció reconeixer el lloc 3’ i recluten la resta de U2 • Interacciones entre ells per dominis RRM (prot-prot)

  21. U2 SF3B Reconstrucció a partir de criomicrografia electrònica de 10Å • P14 (reconeix branch site) • Dominis RRM (intereacció altres prot i amb RNA). Localitzat en les protuberancies del complex • Altres

  22. U2 SF3A • Core Sm U2B’’- U2A’ prot complex (2’4 Å)

  23. snRNA U2

  24. Visió conjunta de U2

  25. U 4/6 • Consta de • Anell Sm • U4 • U6 (act.catalítica) • Auxiliar factors ???

  26. U4/6 Criomicrografia electronica 100 Å

  27. U5 U5 C complex (30 Å)

  28. Conclusió La aproximació estructural al spliceosoma en conjunt és encara impossible. • Falten dades (400 prot – 10 pdb’s) • Complexitat elevada • Dinàmica • Gran tamany • A més al sistema se li han d’afegir les helicases ... Vam concluir que el més raonable és estudiar el spliceosoma per dominis.

  29. MOTIUS COMUNS A MOLTES DE LES PROTEÏNES QUE FORMEN PART DE L’SPLICEOSOME

  30. DOMINIS KH El mòdul KH ( K homology) és unmotiu ubicu d’unió a RNA . Està conservat en organismes molt divergents filogenèticament com àrquees, bactèries i eucariotes Aparició ancestral del domini KH en l’escala evolutiva

  31. DOMINIS KH RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. PDB: 1DT4 CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  32. DOMINIS DINS LA FAMILIA KH • Protein Domains: • 1) Neuro-oncological ventral antigen 1, nova-1, KH3 • 2) Neuro-oncological ventral antigen 2, nova-2, KH3 • 3) Vigilin, KH6 • 4) Fragile X protein, KH1 • 5) HnRNP K, KH3 • 6) RNA splicing factor 1 • 7) Far upstream binding element, FBP, KH3 and KH4 domains Dona nom als dominis “KH” Domini d’Interès en el context del treball

  33. DOMINIS KH DEFINICIÓ de DOMINI KH (I) ~ 70 residus d’extensió Els dominis sovint troben disposats en tàndem (= RRM) Javi. “Maxi KH-Domain”: major grandària ( ~ 100 residus). No repeticions en tàndem. Presents en proteïnes STAR : Signal Transduction Activation RNA (Dominis WW i SH3) El Factor de Splicing 1 (SF1) es una proteïna STAR que conté un domini maxi-KH RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  34. DEFINICIÓ DOMINI KH (II) DOMINIS KH MOTIU ESTRUCTURAL COMÚ: beta-alpha(2)-beta(2)-alpha; 2 layers: alpha/beta - Fulla beta (3 cadenes antiparal·leles) - 3 hèlix alfa. - Loop entre α1- α2:GXXG (VIGXXGXXI) RECONEIXEMENT DE RNA: - Simultani o únic. Motiu: N-Beta-Alfa-Alfa-Beta (la resta estabilitza el domini) - Ampli Rang per al reconeixement de RNA (Inespecífic?) discussió - Reconeixement de 7 a 75 nucleòtids. RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  35. INTERACCIÓ KH-RNA. DOMINIS KH RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. Resolució: 2.60 Angstroms PDB: 1DT4 CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  36. INTERACCIÓ KH-RNA (II) DOMINIS KH Estructura de domini KH + + RNA hairpin (20 nucleòtids) RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. Resolució: 2.60 Angstroms PDB: 1DT4 CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  37. INTERACCIÓ KH-RNA. DOMINIS KH Domini KH: butxaca hidrofòbica RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. Resolució: 2.60 Angstroms PDB: 1DT4 CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  38. FACTOR DE SPLICING 1 (SF1) DOMINIS KH • - Proteïna STAR queS’unex al BPS (Branching point site) de 7 nucleòtids • - A més del domini KH...Domini zinc knuckle: unió inespecífica a RNA • Participa en l’ensamblatge del complex de compromís (Comitment Complex) juntament amb U2AF • - El domini N-ter de SF1 interacciona mab el 3er domini RRM del U2AF65: interacció cooperativa important. La unió de SF1 a BPS i la unió de U2AF65 a PPT són interdependents (Javi) • - Model actual : en l’ensamblatge del Spliceosoma, unió primerenca de SF1, que serà desplaçat per un sistema ATP depenent no identificat encara RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  39. MODEL ACTUAL DE RECONEIXEMENT DEL BPS. DISCUSSIÓ. DOMINIS KH RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. CRYSTAL STRUCTURE OF NOVA-1 KH3 K-HOMOLOGY RNA-BINDING DOMAIN

  40. Zn-Knuckle DOMINIS KH “Nudets de Zenc”: motiu d’unió a nucleòtids format pel consens: CX2CX4HX4C RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. · Present en: - proteïnes gag (nucleocàspida) Empaquetament del genoma víric - proteïnes eucariotes binding RNA o ssDNA

  41. Zn-Knuckle DOMINIS KH Zn 2+ RESOLUTION. 2.60 ANGSTROMS. PDB: 1A6B Resolució: “not applicable”

  42. Domini KH del SF1; Interacció amb RNA PDB 1K1G: RESOLUTION. NOT APPLICABLE.

  43. Domini KH del SF1; Interacció amb RNA

  44. Domini KH del SF1; Interacció amb RNA

  45. Teoria del “meta splicing” · El Facor d’splicing SF1 presenta diverses variants d’splicing · Algunes variants presenten regions C-ter riques en Prolina Interacció amb dominis SH3 i WW · yFBP11: proteïna amb domini WW. Relacionada amb U1snRNP, que al seu temps interaccionarà amb ySF1. Especulació: Autorregulació del reconeixement del lloc d’splicing via senyalització mediada per les pròpies variants d’splicing del SF1

  46. DOMINIS KH: “EL FET DIFERENCIAL” KH domains: Proteïnes extranyes - Presenten alta similaritat de seqüència el les regions del motiu d’unió a RNA. - Diferenttopologia. Exemple únic de proteïnes amb seqüencies similars i plegaments considerablement diferents hnRNP (eucariota) S3 (procariota)

  47. Psi-blast hnRNP. Sequences producing significant alignments: (bits) Valuepdb|1KHM|1KHM-A hnrnp kfragment: c-terminal kh domain, residues ... 116 9e-28pdb|1EC6|1EC6-B RNA-binding protein nova-2fragment: kh3;(astrocy... 95 3e-21pdb|1EC6|1EC6-A RNA-binding protein nova-2fragment: kh3;(astrocy... 95 4e-21pdb|1DT4|1DT4-A neuro-oncological ventral antigen 1fragment: thi... 89 3e-19pdb|1VIG|1VIG vigilinfragment: kh6, residues 432 to 501; 37 0.001pdb|1VIH|1VIH vigilinfragment: kh6, residues 432 to 501; 37 0.001pdb|1K1G|1K1G-A sf1-bo isoformfragment: residues 133-260, kh-qua... 26 3.1pdb|1ALB|1ALB Adipocyte lipid-binding protein 25 3.6pdb|1LIC|1LIC Adipocyte lipid-binding protein complexed with hex... 25 3.6pdb|2ANS|2ANS-A adipocyte lipid-binding protein(albp, ap2, a-fabp) 25 3.6pdb|1A18|1A18 adipocyte lipid binding protein(albp-phen) 25 3.8pdb|1A2D|1A2D-A adipocyte lipid binding protein(albp-px) 25 3.8pdb|2EFG|2EFG-A elongation factor g(ef-g)elongation factor g dom... 24 8.5pdb|1EFG|1EFG-A Elongation factor g complexed with guanosine 5'-... 24 8.6pdb|1ELO|1ELO elongation factor g(translocase) 24 8.9pdb|1FNM|1FNM-A elongation factor g(ef-g)Mutant 24 9.2pdb|1FJF|1FJF-C 16s ribosomal RNAfragment of messenger RNA30s ri... 24 9.2pdb|1FJG|1FJG-C 16s ribosomal RNAfragment of messenger RNA30s ri... 24 9.2pdb|1GIX|1GIX-F 30s 16s ribosomal RNAtrna(phe)trna(phe)a- and p-... 24 9.2pdb|1JQM|1JQM-B 50s ribosomal protein l11elongation factor g(ef-... 24 9.6 Score = 24.0 bits (52), Expect = 9.2Identities = 8/17 (47%), Positives = 13/17 (76%)

  48. Proteïna s3

  49. Topologia KH eucariota vs el procariota • Motiu local implicat en la unió a nucleòtids: conservat. βααβ • Plegament global: diferent. Diferents extensions en N-ter i C-ter per estabilitzar el domini.

More Related