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Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS. Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP. bandeamento. cariótipo. culturas. aCGH. FISH. CGH. SKY. ISH. CITOGENÉTICA CLÁSSICA.

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  1. TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

  2. bandeamento cariótipo culturas aCGH FISH CGH SKY ISH CITOGENÉTICA CLÁSSICA CITOGENÉTICA MOLECULAR ... 1956 Tijio e Levan 1960 Moorhead et al. 1970 1969 Gall e Pardue 1986 Pinkel et al. 1992 Kallioniemi et al. 1996 Schröck et al. 2002 Nakakuki et al.

  3. CULTURA DE LINFÓCITOSMoorhead et al, 1960 1. Colheita de 5 ml de sangue e sedimentação 2. Montagem da cultura: • meio de cultura (antibióticos) e soro fetal bovino • estímulo da divisão celular: fito-hemaglutinina (feijão Phaseolus vulgaris) • cultivoem estufa a 37° C, por72 horas 3. Bloqueio da divisão celular com colquicina: impede a formação do fuso mitótico  acúmulo de metáfases 4. Colheita da cultura: • hipotonização: KCl 0,075M  intumescimento das células e separação das cromátides • Fixação:metanol: ácido acético (3:1) preserva a estrutura dos cromossomos

  4. www.geneticamedica.com.br/.../ citogenetica.htm

  5. BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO • Coloração usual com Giemsa • Bandeamento Q • Bandeamento G • Bandeamento R • Bandeamento C • Coloração Ag-NOR

  6. COLORAÇÃO USUAL coloração uniforme dos cromossomos:identificação morfológica dos pares cromossômicos: 1, 2, 3, 16, 17, 18 e Y. Classificação dos cromossomos em grupos: A - G

  7. CLASSIFICAÇÃO DOS CROMOSSOMOS HUMANOS (GRUPOS A – G) • Grupo A (1-3): 3 pares de cromossomos gandes A1 e A3 metacêntricos A2 submetacêntrico • Grupo B (4-5): 2 pares submetacêntricos grandes • Grupo C (6-12+X): 7 pares submetacêntricos médio + X • Grupo D (13-15): 3 pares acrocêntricos médio (satélite) • Grupo E (16-18): 3 pares de cromossomos pequenos 16 metacêntrico 17 e 18 submetacêntricos • Grupo F (19-20): 2 pares metacêntricos pequenos • Grupo G (21-22+Y): 2 pares acrocêntricos pequenos (satélite) + Y

  8. 46,XY biocarampangue.tripod.com/ Segundo-medio.htm

  9. Tratamento com tripsina e coloração com Giemsa Bandas claras e escuras intercaladas (450 bandas) Bandas G+ricas em AT (pobre em genes) Bandas G-ricas em GC (rica em genes) Identificação de alterações estruturais e pareamento dos cromossomos BANDA GTG: Seabright (1971)

  10. http://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S1413-81232002000300013&script=sci_arttexthttp://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S1413-81232002000300013&script=sci_arttext www.ucm.es/.../AVG/practicas/ cariotipo/carioP.htm

  11. Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações • Perda: • deleção • monossomia • Ganho: • duplicação, amplificação trissomia, poliploidia • Relocação: • translocação • inversão • inserção

  12. CULTURA CELULAR E BANDA G 500 bandas Resolução: ~6milhões pb ~50genes/banda >4 Mb

  13. cora regiões centroméricas e heterocromatina constitutiva: constrições secundárias dos cromossomos 1, 9, 16 e Yq. tratamento em ácido (HCl) e alcali Ba(OH)2 regiões de heterocromatina constitutiva: coradas fortemente  DNA da cromatina eucromatina  é extraído (solubilizado). BANDA C (Sumner, 1972)

  14. BANDA C - POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS 1 9 16 46,XY, 1qh+,inv(9q) 46,XX,1qh+ 46,XY, inv(9q)

  15. destaca as regiões do rDNA: RON  constrições secundárias dos cromossomos com satélite (braços curtos dos acrocêntricos) (deposição de prata) o número de NORs/ metáfase: varia entre 5 a 10 Impregnação pela prata nos cistrons ribossômicos ativos na intérfase anterior BANDA Ag-NOR – COLORAÇÃO POR PRATA

  16. COLORAÇÃO Ag-NORAssociação de satélites

  17. ORDEM DAS ANOMALIAS CROMOSSÔMICASSISTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA DOS CROMOSSOMOS HUMANOS - 1995 • Primeiro aberrações dos cr. Sexuais (X antes do Y) • Aberrações dos autossomos em ordem numérica, independente do tipo de aberração • Aberrações numéricas listadas antes das estruturais • Várias alterações estruturais em ordem alfabética • Exemplos: • 47,Y,t(X;13)(q27;q12),inv(10)(p13q22), +21 • 48,X,t(Y;12)(q11;p12),del(6)(q11),+8,t(9;22)(q34;q11),+1, • 7,-21,+22 • 50,XX,+1,+del(1)(p13),+dup(1)(q21q32),+inv(1)(p31q41),+8,+r(10)(p12q25),-21

  18. CARIÓTIPO COMPOSTO 42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22 43,XX,-6,-11,-21 43,XX,-14,-18,-22 43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20 45,XX,-7 45,XX,-16 45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8 46,XX [4] 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7] 46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8 Cariótipo composto: 42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]

  19. ALTERAÇÕES CLONAIS Ter pelo menos 2 células com a mesma aberração:ganho cromossômico (trissomia) ou rearranjo estrutural Clone: população de células derivada de um único progenitor. Alteração clonal: quando um número de células têm o mesmo ou proximamente relacionado complemento cromossômico anormal. Ter pelo menos 3 células com perda cromossômica (monossomia)

  20. ALTERAÇÕES CLONAIS 42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22 43,XX,-6,-11,-21 43,XX,-14,-18,-22 43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20 45,XX,-7 45,XX,-16 45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8 46,XX [4] 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7] 46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8 Numéricas: +5[2], -8[3] Estrutural: ins(4;2)(q31;q24q32)[11] Cariótipo composto: 42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]

  21. TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR • FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação) • SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações) • M-BAND: Bandeamento colorido (inversão, deleção/duplicação) • CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos) • Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

  22. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTEFISH Pinkel et al. (1986)

  23. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE • FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)

  24. DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica Sonda: segmento de DNA específico

  25. ETAPAS Preparação da lâmina (DNA alvo) Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa To de ~80oC Fluorocromos: Sondas FITC-fluoresceína (verde) Espectrum green ( verde) Rodamina (vermelho) Texas red (vermelho) Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight) Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio) Detecção da sonda e contracoloração:iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

  26. ETAPAS Material: -núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços -cromossomos metafásicos: cultura celular

  27. ETAPAS (Ácido acético, RNase, pepsina Desidratação Etanol)

  28. http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm -ANIMAÇÃO ETAPAS Hibridização (câmera úmida à 37oc) Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

  29. TIPOS DE SONDAS • Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas: -sonda alfa-satélite (centromérica) -sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G) -sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y) -sonda telomérica (telômeros) • Sondas de cópia única ou locus específica • Sondas de cromossomo inteiro (WCP)

  30. SONDAS CENTROMÉRICAS Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

  31. SONDAS CENTROMÉRICAS gastrite:-7 gastrite:+7 APLICAÇÃO: aneuploidias em núcleos interfásicos úlcera:+8 Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

  32. SONDAS TELOMÉRICAS Aplicação: -Deleções terminais -perdas teloméricas

  33. SONDAS TELOMÉRICAS (cromossomo 5)

  34. SONDAS LOCUS ESPECÍFICA del (22q11.2) Diagnóstico de doenças com microdeleção

  35. SONDAS LOCUS ESPECÍFICA Adenocarcinoma gástrico: Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53(vermelho) 17(verde) Deleção do gene TP53 em câncer gástrico

  36. SONDAS WCP – Cromossomo Total http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842005000100018

  37. SONDAS WCP – Cromossomo Total A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4; material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).

  38. APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH Mapeamento de genes e sequências gênicas Estrutura e organização dos cromossomos Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções Identificação de alterações cromossômicas em esperma Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto) Diagnóstico de neoplasias

  39. MICRODISSECÇÃO http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/microDissection.php

  40. APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

  41. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH • Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais • Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 dias • FISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

  42. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

  43. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH Trissomia do 21 Triplo X Normal

  44. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO 3 sinais verde: blastômero com trissomia do 21

  45. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS AMPLIFICAÇÃO GÊNICA CCND1, c-MYC, HER2/Neu TRANSLOCAÇÕES t(9,22); t(8;14) DELEÇÕES TP53 (17p13), RB (13q13)

  46. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS Amplificação Gênica

  47. DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS Amplificação Gênica (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

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