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Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do Trato Digestório. Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP. NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO. CÂNCER DE ESÔFAGO: 3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos)

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  1. Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do Trato Digestório Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

  2. NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO CÂNCER DE ESÔFAGO: 3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos) ~85% carcinomas CÂNCER GÁSTRICO: 2º tipo (mundo) 3º tipo Brasil (23.200 casos) ~95% adenocarcinomas

  3. CARCINOGÊNESE DO ESÔFAGO ÁLCOOL E FUMO FATORES DE RISCO Ambiental e genéticos História familial Agentes infecciosos (HPV) Megaesôfago chagásico Esôfago de Barrett Lesões cáusticas Aneuploidias Mutação genes supressores: TP53, P16, P17, FHIT Ativação de oncogenes: CCND1, HER-2/neu

  4. Doença de Chagas - Fase crônica Brasil: 50-60% chagásicos na fase crônica sem manifestações clínicas 2-4% fase crônica sintomática Intestino grosso (megacólon) Coração Esôfago (megaesôfago) 80%

  5. Risco de 3-8% Megaesôfago chagásico Carcinoma de células escamosas do esôfago • Complicação tardia mais séria do megaesôfago • 5% dos pacientes com MC em idade mais jovem em relação àqueles sem a doença • Contato prolongado de agentes carcinógenos alimentares com a mucosa  estase alimentar  aumento do crescimento bacteriano e irritação química  esofagite crônica

  6. C ARCINOMA DE ESÔFAGO Chagásicos crônicos: com e sem megaesôfago Esofagites crônicas Megaesôfago chagásico (MC) FISH: aneuploidias 7, 11, 17 deleção TP53 amplificação CCND1 Imuno: Expressão proteínas: p53, p16 e fhit Apoptose: caspase-3 ativada Proliferação celular: antígeno Ki-67 Molecular: Mutações TP53, MTS-1 e FHIT (PCR-SSCP, sequenciamento) T. cruzi: polimorfismos do kDNA (sangue e mucosa) CGH MC:60% aneuploidias (-7,+7, -17, +17) 54,5% deleção TP53 CE:100% tri e tetrassomias 100% deleção TP53 70% CCND1

  7. CARCINOGÊNESE GÁSTRICA

  8. CÂNCER GÁSTRICO • Incidência elevada: Japão, China, Costa Rica, Chile e Portugal • Brasil: Estimativas para 2006 (INCA) • 23.200 casos novos • Homens: 2x mais afetados

  9. TIPOS HISTOLÓGICOS DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO • ADENOCARCINOMA TIPO INTESTINAL OU BEM DIFERENCIADO: • Presença de lesões pré-neoplásicas • Predominante em homens e idosos • ADENOCARCINOMA TIPO DIFUSO OU POUCO DIFERENCIADO: • Prognóstico pior • Não associado a lesões pré-cancerosas • Mais frequente em mulheres e jovens

  10. Helicobacter pylori Lesões pré-cancerosas Predisposição Genética Gastrectomia Anterior Tabaco Lesões do DNA Álcool Alimentos salgados , enlatados e defumados CARCINOGÊNESE GÁSTRICA

  11. Colonização da mucosa gástrica pela Helicobacter pylori (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000) • Prevalência da Hp: 40 a 50% na população •  9 vezes risco de câncer gástrico • Geração de radicais livres (espécies de oxigênio e nitrogênio reativos) → danos no DNA • Alterações na secreção de fatores de crescimento e citocinas • Desregulação do ciclo celular do epitélio gástrico → proliferação celular ↑ x apoptose ↑

  12. + + Estômago Normal Gastrite H.pylori Úlcera Gastrite atrófica Apoptose regulada Apoptose ­ Apoptose ­­ Inflamação TNF  CD95 NO Inflamação TNF  CD95 NO Proliferação regulada Proliferação ­ Proliferação ¯ Desequilíbrio (perda de células) Homeostase (renovação celular normal) Homeostase (­ da proliferação celular) HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA (modificado Wagner et al., 1997)

  13. CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO • Alterações genéticas e epigenéticas • Oncogenes • Genes supressores de tumor • Reguladores do ciclo celular • Moléculas de adesão celular (caderinas) • Genes de reparo do DNA • Instabilidade genética • Ativação de telomerases

  14. PERDAS E GANHOS CROMOSSÔMICOS Cromossomos Regiões Cromossômicas Genes 1 1p (1p36) ; 1q22-q31 p73 2 2pter-p23; 2q; 2q 3 3p14; 3q (3q12-qter) FHIT 4 4q32 5 5q21 APC 7 7pq; 7q22; 7q31 ERBB; EGFR, HGF; c-MET 8 8pq; 8q (8q23-24) c-MYC 9 9p (9p21) CDKN2A (p21) 12 12q (12q24) EPS8; DOC-1 13 13q (13q21-22) receptor de serotonina 14 14q (14q24) 15 15q (15q11-q15) 16 16pq, 16q22 E-Caderina 17 17p (17p13); 17q; 17q (17q12-q21) TP53, c-ERBB2, gastrina 18 18q21; 18q DCC 19 19p(19p13); 19q(19q13) 20 20pq; 20q11-q12 22 22q

  15. CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO(modificado Tahara, 2004) INTESTINAL C-ERBB2 C-MET CICLINA E TP53 APC TP53 p27 D1S191 HIPERMETLAÇÃO MUCOSA NORMAL METAPLASIA INTESTINAL ADENOMA CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO CÂNCER AVANÇADO INVASÃO METÁSTASES LOH 1p36 (p73) LOH 7q  p27  TELOMERASE hTERT H. pylori  TELÔMEROS INSTABILIDADE GENÉTICA CD44 ALTERADO  CICLINA E CD44 ALTERADO CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO CÂNCER AVANÇADO INVASÃO METÁSTASES MUCOSA NORMAL LOH 17q21 MUTAÇÃO/PERDA E CADERINA AMPLIFICAÇÃO K-SAM c-MET DIFUSO MUTAÇÃO/LOH TP53

  16. Escasses de estudos genéticos em lesões gástricas precursoras com potencial pré-neoplásico  indicar marcadores cromossômicos associados com a carcinogênese gástrica FISH -aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -deleções no gene TP53, -amplificação CCND1 e Her-2/neu (c-erbb-2) lesões gástricas benignas e adenocarcinoma gástrico MOLECULAR Avaliação da H. pylori Polimorfismos: CYP, GST, XRCC1, XRCC3,COX2, NOS2 Expressão gênica: PCR Real Time RaSH (hibridação subtrativa rápida) Metilação IMUNO-HISTOQUÍMICA expressão das proteínas: -p53 -ciclina D1 e p185 (Her-2/neu) Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles de adenocarcinomas gástricos  ressaltar alterações genéticas que possam estar relacionadas com a progressão das lesões benignas, e maior risco de malignização  utilizadas no diagnóstico precoce e prognóstico

  17. MATERIAL • Controle: 10 biópsias mucosas gástricas histologicamente normais e H. pylori negativas • Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico) • 38 gastrites crônicas • 13 gastrites atróficas crônicas • 21 úlceras gástricas • 21 metaplasias intestinais • 20 adenocarcinomas gástricos

  18. Gastrite crônica e gastrite atrófica  associada com H. pylori  precede a formação do câncer gástrico • Úlcera péptica  maior risco de câncer gástrico • Objetivos: avaliar a ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17); deleção e expressão do gene TP53. • Amostras: 38 gastrite crônica • 13 gastrite atrófica • 21 úlcera gástrica

  19. Aneuploidias: frequência crescente de GC (21%) para GAC (31%) e para UG (62%) Gastrite crônica: 8/38 casos  -7, +7  75% Hp+ Gastrite atrófica crônica: 4/13 casos  +7, +8  100% Hp+ Deleção TP53: não observada Expressão aumentada da p53: Gastrite crônica: 5/11 (45%)

  20. Úlcera gástrica: 13/21 casos (62%)  +7,+8; +17  69% Hp+ Expressão aumentada da p53: 2/17 (12%)

  21. GC: +7 GC: -7 UG: +8 ↑p53 em GC e UG: super expressão da proteína selvagem → resposta fisiológica ao processo inflamatório do epitélio gástrico (H. pylori)

  22. Metaplasia intestinal: (substituição do epitélio gástrico por células colunares intestinal) • Alguns estudos: mutação do TP53 e superexpressão da proteína p53 em metaplasia adjacente ao tumor. • Objetivo: • Investigar ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17), deleção e expressão do gene TP53, em metaplasia intestinal de pacientes sem câncer gástrico.

  23. 60% (3/5) casos: deleção TP53 • 12% (2/17) casos: expressão  p53 • 71% (15/21) casos MI: aneuploidias +7, +8, +9 • Associação: aneuploidias x H. pylori

  24. 100% casos: aneuploidias (tri/tetra) • 30% (6/20 ): trissomias múltiplas • 3/3 casos: deleção TP53 • 80% (12/15): expressão  p53

  25. Metaplasia: +7 Adenocarcinoma +9; +17 adenocarcinoma Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53(vermelho) 17(verde)

  26. AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E COMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIAS monossomias trissomias

  27. IMUNO-HISTOQUÍMICA – p53 Metaplasia p53+ (fraca) Mucosa normal p53- Adenocarcinoma p53+ (forte)

  28. Cromossomos 7, 8, 9 e 17  carregam genes importantes que atuam no controle da proliferação celular • 7q31: MET • 8q24: MYC • 9p21: CDKN2A • 17p13: TP53 • 17q21: ERBB-2 (HER-2/NEU) • Primeira evidência de alterações numéricas em MI de pacientes sem câncer gástrico  alterações presentes em frequências  adenocarcinoma  conecção cronológica entre essas lesões  expansão monoclonal • Ocorrência de instabilidade cromossômica em lesões benignas (GC e UG) que podem ter função importante na carcinogênese do estômago Dosagem anormal e expressão gênica  vantagem proliferativa

  29. APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H. pylori AND EXPRESSIONS OF p53 • Apoptose: homeostase do tecido  equilíbrio entre proliferação e morte celular programada • Desequilibrio: taxa proliferativa excessiva  potencializa o efeito de carcinógenos  risco de câncer • Associação: H. pylori x Apoptose  lesões gástricas ??? • H. pylori: risco de 2,7 a 12 vezes de câncer gástrico

  30. OBJETIVO: avaliar os IA em diferentes lesões gástricas e comparar com adenocarcinoma gástrico  técnicas que detectam apoptose em fases diferentes: • Caspase-3 ativada (CPP32)  mais precoce • TUNEL  fragmentação do DNA • Associar com H. pylori, aneuploidias e expressão da p53 • AM0STRAS: 8 mucosa normal Hp- • 34 gastrite crônica • 11 gastrite atrófica • 17 úlcera gástrica • 12 adenocarcinomas

  31. IA aumentados: TUNEL: GAC CPP32: GC Adenocarcinomas: IA baixos, sem diferença entre intestinal e difuso

  32. Table 2 – Aneuploidy, TP53 gene deletion and expression, and clinicopathological data in chronic gastritis (CG), atrophic gastritis (CAG) and gastric ulcer (GU) cases. TUNEL CPP32 B A D C E F H G A-B:gastrite crônica C-D: úlcera gástrica E-F: metaplasia intestinal G-H: adenocarcinoma gástrico

  33. CONCLUSÕES • Não houve associação entre apoptose aumentada e infecção pela H. pylori, aneuploidias e super expressão da proteína p53 • não houve correlação entre os IA encontrados por ambas as técnicas, • aumento de apoptose em GC e GAC, não relacionado com infecção pela H. pylori reforçando a participação de lesões gástricas com potencial pré-canceroso na tumorigênese do estômago  enfatiza a importância do emprego de métodos diferentes para detecção de apoptose.

  34. Double minutes (DM) aumento do número de cópias: dezenas a centenas de vezes (erros de replicação) Aumento da expressão gênica→proteína Regiões homogeneamente coradas (HSR)

  35. Carcinogênese: Genes Amplificados -CCND1 -c-MET -c-MYC -c-ERBB-2 (HER-2/NEU)

  36. -40 carcinoma esôfago -12 mucosa normal -40 adenocarcinoma gástrico -14 mucosa normal Avaliar a relação entre amplificação e polissomia de CCND1 e Her-2/neu com expressão aumentada das proteínas e aspectos clinicopatológicos→prognóstico IMUNO Anticorpos: ciclina D1(nuclear) Her-2 (membrana) FISH Cyclin D1 (vermelho) Her-2 (vermelho) Centrômeros (verde)

  37. AMPLIFICAÇÃO: CCND1: carcinoma esôfago 45% (18/40) câncer gástrico 10% (4/40) HER-2/NEU: carcinoma esôfago 7,5% (3/40) câncer gástrico 5% (2/40) IMUNO: Cyclin D1+: câncer esôfago 37,5% (15/40) câncer gástrico 35% (14/40) Her-2/neu+: câncer esôfago 12,5% (5/40) câncer gástrico 7,5% (3/40)

  38. FISH: (A-B) Amplificação CCND1( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 11 (verde) gene CCND1 (vermelho)

  39. FISH: (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

  40. IMUNO: (A-B) proteína Cyclin D1+ câncer esôfago e gástrico (C-D) proteína Her-2+ câncer esôfago e gástrico

  41. CONCLUSÕES: -CCND1: mais frequentemente amplificado e proteína super-expressada (ambas neoplasias) → função na progressão de infiltração e metástases → marcador molecular → prognóstico pior e comportamento mais agressivo → invasão, metástases, recorrência e sobrevida reduzida, -Baixa associação entre amplificação x super-expressão → outras vias de expressão alteração na síntese ou estabilidade da proteína alterações na regulação de transcrição gênica

  42. EQUIPE • COORDENADORA: • Profa. Dra Ana Elizabete Silva – UNESP • COLABORADORES: • Profa. Dra. Marileila Varella-Garcia – Cancer Center-USA • Prof. Dr. Aldenis Albaneze Borim – FAMERP • Profa. Dra. Patrícia Maluf Cury – FAMERP • Dr. Alaor Caetano – FAMERP • Profa. Dra. Kátia Ramos Lopes – Hospital Sírio Libânes - SP • PÓS-GRADUANDOS: • Ana Cristina Gobbo César • Lucimari Bizari • Fernanda da Silva Manoel Caetano • Marilanda Ferreira Bellini • Márcia Cristina Duarte • Juliana Garcia de Oliveira • Aline Cristina Targa • Aparecida Perpétuo Fedossi • Héctor Matiolli • INICIAÇÃO CIENTÍFICA: • Isabella Katz Migliori • Yvana Cristina Jorge • Auxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPq

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