1 / 82

2. ALLOSTERIE

2. ALLOSTERIE . Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického enzymu. Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a Mentenové. Modely allosterie:

avari
Télécharger la présentation

2. ALLOSTERIE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. 2. ALLOSTERIE • Aspartáttranskarbamoylasa jako příklad allosterického enzymu. • Allosterické enzymy se neřídí kinetikou Michaelise a Mentenové. • Modely allosterie: • Symetrický model ( Jacques Monod, Jeffries Wyman a Jean-Pierre Changeux – podle autorů zkracovaný jako MWC model). Angl. concerted (přel. současný) • Sekvenční model (Daniel Koshland). • Conceptual insights – Stryer, Chapter 10. • Hemoglobin je příkladem neenzymového allosterického proteinu

  2. Enzym Aspartáttranskarbamoylasa (EC 2.1.3.2) je allostericky inhibován konečným produktem metabolické cesty cytidintrifosfátem (CTP).Inhibice zpětnou vazbou.ATCasa katalyzuje kritický stupeň kondenzace Asp s karbamoylfosfátem při syntéze pyrimidinových nukleotidů.

  3. Cytidintrifosfát (CTP) inhibuje ATCasu. Podobnost mezi substrátem a produktem není žádná.

  4. Od slide 6 po slide 13 je prezentován způsob objasnění struktury ATCasy. Není podstané pro pochopení principu allosterie !!Modifikace cysteinových vedlejších řetězců (ATCasy). Oddělení podjednotek chromatografií na iontoměniči nebo centrifugací.

  5. Centrifugační studie ATCasy. • Centrifugace v gradientu sacharosy. • Sedimentační koeficient nativního enzymu je 11,6 S. • Dvě podjednotky 2,8 S a 5,8 S. • Svedberg (zkratka S či Sv), též Svedbergova jednotka, je odvozená jednotka fyzikální veličiny známé jako sedimentační koeficient. • Tato veličina udává čas, za který proběhne sedimentace dané makromolekuly při její ultracentrifugaci. • Platí: 1 Svedberg = 1 S = 10-13 sekundy • Jak od sebe oddělíme obě podjednotky a jak lze odstranit p-hydroxymerkuribenzoát ? • Větší podjednotka (c) je katalytická, ale není inhibována CTP. Složena ze tří řetězců po 34 kD se označuje c3. • Regulační podjednotka (r) váže CTP. Složena ze dvou řetězců po 17 kD je označena r2. • Nativní enzym je složen ze dvou katalytických trimerů a tří regulačních dimerů (2 c3 + 3 r2 = c6r6).

  6. Ultracentrifugační studie ATCasy. A) Sedimentační rychlost nativní ATCasy. B) Enyzm po působení p-hydroxymerkuribenzoanu. Enzym disocioval na regulační (r) a katalytické podjednotky (c).

  7. Kvarterní struktura ATCasy. Vpravo je zjednodušený pohled. Katalytické trimery jsou dva (druhý je zakrytý). Regulační dimery jsou tři. 2 c3 + 3 r2 = c6r6

  8. Strukturní podobnost mezi reakčním produktem ATCasy N-fosfonokarbamoylaspartátem a PALA (bisubstrátový analog reakčního meziproduktu). Krystalizace ACTasy za přítomnosti PALA - lokalizace aktivního místa.

  9. Aktivní místo ATCasy-trimer. V aktivním místě, které obsahuje hlavně vedlejší skupiny z jedné podjednotky, ale také část druhé podjednotky (zeleně), je vázán PALA.

  10. ATCasa existuje ve dvou konformacích: kompaktní , relativně inaktivní označovaná jako T (tense) a uvolněná (relaxed) označovaná R. PALA stabilizuje R stav.ATCasa splňuje kritéria symetrického modelu.

  11. Cytidintrifosfát (CTP) stabilizuje T stav. CTP se váže na regulační podjednotky ATCasy.

  12. T a R stavy v rovnováze. I v situaci bez přítomnosti substrátu existuje ATCasa v rovnováze obou stavů. Bez substrátu převažuje T nad R stavem faktorem 200.

  13. ATCase vykazuje sigmoidní kinetiku. Základní podmínka allosterie proteinu: a) Kvartérní struktura (složen z podjednotek). b)Závislostrychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu je esovitá křivka – sigmoidní tvar.

  14. Tvorbu sigmoidní křivky lze interpretovat jako směs dvou Michaelis-Mentenovských enzymů, jeden s vysokou hodnotou KM odpovídající T stavu a druhý s nízkou hodnotou KM odpovídající R stavu. S růstem koncentrací substrátu se rovnováha posunuje od T k R stavu.

  15. Vliv CTP na kinetiku ATCasy. CTP je allosterický inhibitor, stabilizuje T stav. Znesnadňuje vstup substrátu do aktivního místa.

  16. Vliv ATP na kinetiku ATCasy. ATP je alosterický aktivátor. Stabilizuje stav R – usnadněný vstup substrátu do aktivního místa.

  17. Působení substrátů na allosterické enzymy se označuje jako homotropní efekt (z řečtiny „stejný“). • Působení nesubstrátových molekul na allosterické enzymy jako např. CTP a ATP na ATCasu se označuje jako heterotropní efekt. • Zkuste uvažovat proč působí ATP jako aktivátor ATCasy (fyziologická úvaha).

  18. Glukokinasa • Glukokinasa (EC 2.7.1. 2), systematický název: ATP:D-glukosa 6-fosfotransferasajeenzym katalyzující fosforylaci glukosy na glukosa-6-fosfát. Glukokinasa je přítomna v buňkách jater, pankreatu, mozku, střevě lidí a mnoha obratlovců. V každém z těchto orgánů hraje významnou roli při regulaci metabolismu sacharidů. Působí jako glukosový sensor. Reaguje na změny hladin glukosy při hladovění nebo nasycení. • Glukokinasa (GK) je hexokinasový izozym homologní s dalšími hexokinasami. • GK je kódovaná odlišným genem, na rozdíl od hexokinas, má také odlišné kinetické vlastnosti a s tím související různé odlišné funkce. • GK má, na rozdíl od ostatních hexokinas, nižší afinitu ke glukose a její aktivita je lokalizována jen v několika typech buněk.

  19. Glukokinasa • GK mění svoji strukturu v závislosti na koncentraci glukosy. Je saturována při koncentraci glukosy 8 mM/L. • GK není inhibována produktem – glukosa-6-fosfátem !!!! • GK vykazuje, ač monomer, kooperativitu – allosterické chování !!! • GK je monomer 465 aminokyselin o molekulové hmotnosti 50kD. Na molekule enzymu jsou dvě vazebná místa. Jedno pro substráty (aktivní místo) vážící glukosu a MgATP a druhé, pravděpodobně, pro allosterický aktivátor-inhibitor, které dosud nebyly jednoznačně identifikovány. Ostatní hexokinasy jsou dimery. • GK – aktivita může být zvyšována nebo redukována v minutových intervalech glukokinasovým regulačním proteinem(GKRP).

  20. Glukokinasa s v aktivním místě vázanou glukosou

  21. Dva modely allosterie. • Symetrický model ( Jacques Monod, Jeffries Wyman a Jean-Pierre Changeux – podle autorů zkracovaný jako MWC model). • Sekvenční model (Daniel Koshland).

  22. Conceptual insights – Chapter 10.

  23. Kvantitativní popis modelu MWC. Frakční aktivita Yf je část aktivních míst s navázaným substrátem úměrná reakční rychlosti. aje poměr [ S ] / disociační konstantě S s enzymem ve stavu R; L je poměr koncentrací enzymu ve stavu T k enzymu ve stavu R. Vazba regulátorů ATP a CTP mění hodnotu L.

  24. Symetrický (MWC) model – kvantitativní formulace. • Mějme enzym s n aktivními místy. • Dva stavy enzymu v rovnováze: R – vysoká afinita k substrátu, T - nízká afinita k substrátu. Definujeme c jako poměr afinit obou forem enzymu k substrátu S, měřeno jako disociační konstanty.

  25. Frakční aktivita Y, je frakce aktivních míst s navázanými substráty. Je přímo úměrná reakční rychlosti. aje poměr [ S ] ku disociační konstantě S v komplexu s enzymem v R stavu. • L je poměr koncentrace enzymu v T stavu ku koncentraci enzymu v R stavu (KR). • Vazba regulátorů jako je ATP nebo CTP na ATCasu mění hodnotu L a tím odezvu na koncentraci substrátu.

  26. Příklad využití kvantitativního modelu s daty ATCasy. • U ATCasy se n = 6. • Vynikajícího souhlasu s experimentálními daty se dosahuje při L = 200 a c = 0, 1. • Z toho plyne, že za absence vázaného substrátu je posunuta rovnováha na stranu T faktorem 200 ( pouze 1 molekula z 200 je ve stavu R) a afinita R stavu k substrátu je 10x vyšší než ke stavu T. Když se substrát váže do každého aktivního místa, rovnováha se posouvá k R. • Např.:Pokud je obsazena polovina aktivních míst substrátem(tři ze šesti) je poměr T/R 1 : 5. Znamená to, že téměř všechny molekuly jsou ve stavu R.

  27. Vliv CTP a ATP se řeší jednoduše změnou hodnoty L. • Při saturaci CTP se hodnota L zvyšuje na 1 250. To znamená, že je třeba daleko více substrátu k posunu rovnováhy do stavu R. Při saturaci ATP klesá hodnota L na 70.

  28. SEKVENČNÍ MODEL • Daniel KOSHLAND – postupná vazba ligandů (substrátů) na podjednotkyproteinu vede k postupnému vzájemnému ovlivňování jednotlivých podjednotek. • Možno vysvětlit i negativní kooperaci. • U symetrického modelu (MWC) přechází celý enzym z jednoho stavu do druhého (T a R).

  29. Jednoduchý sekvenční model tetramerního allosterického enzymu. Postupnou vazbou substrátu na podjednotky se mění konformace okolních ze stavu T na R.

  30. Max Perutz (1914 – 2002) a John Kendrew – Nobelova cena za chemii v roce 1962. • Max Perutz pracoval na rentgenové struktuře Hb více než 30 let na Univerzitě v Cambridge (UK). Struktura o rozlišení 2, 8 Å byla získána až v roce 1968. • John Kendrew navazoval na M. Perutze, Objasnil strukturu velrybího myoglobinu – rentgenostrukturní analýzou, metodou isomorfní záměny. Těžký atom jako Hg2+ (bohatý na elektrony) se musí vázat na protein, tak, aby nedošlo ke změně struktury. Dochází k podstatné změně v intenzitě odrazu, ale ne v pozici elektronové hustoty.

  31. Kvartérní struktura hemoglobinu – dva řetězce a a dva b tvoří pár ab dimerů – heterotetramer a2b2.

  32. Kooperativní zvýšení transportu kyslíku u hemoglobinu. Kooperativita mezi vazebnými místy pro kyslík vede k zásobení tkání větším množstvím kyslíku (1, 7x) než by mohl nekooperativní protein. (pO2 je parciální tlak kyslíku).

  33. Jednotky tlaku • 1 torr = 1 mm Hg ≈ 133,322 Pa • Pascal (značka Pa) je základní jednotka tlaku. Udává, jak velká síla (v Newtonech) působí na jednotkovou plochu (1 m2), tzn. je ekvivalentní N/m². • 1 hPa = 100 Pa = 1 mb (milibar)1 Pa = 1 N/m21 hPa = 100Pa1 kPa = 1000 Pa • 760 torrů ≈ 101,325 hPa • 1 atm = 101 325 Pa = 101,325 kPa = 0,101325 MPa = 760 torr • Parciální tlak plynu ve směsi je tlak, který by tento plyn vykazoval, pokud by byl v celém objemu sám.

  34. Krevní oběh – srdce a plíce. Formy Hb: HbO2 = oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, Mb = svalový myoglobin.

  35. Karbonátanhydratasa EC 4.2.1.1 (metaloenzym – Zn2+) Zkratka CA.

  36. Aktivní místo živočišné a-CA (Zn2+ je vázán na tři imidazolové zbytky His)

  37. Reakce katalyzované CA. • Reakce katalyzovaná CA: • CO2 + H2O  HCO3- + H+ (za situace vysoké koncentrace CO2 v tkáních) • Velmi rychlá reakce – 104 až 106 obratů za sekundu (číslo přeměny). Limitováno jen difůzí !!! • Zpětná reakce: • HCO3- + H+ H2CO3 CO2 + H2O (v plících a nefronech ledvin za stavu nízké koncentrace CO2 , v rostlinách).

  38. Funkce CA • Primární funkcí CA u živočichů je udržování rovnováhy mezi CO2 a hydrgenuhličitanem za účelem udržování acidobazické rovnováhy v krvi a tkáních. Další funkcí je role CA při transportu CO2 z tkání. • Existuje 14 různých izoforem CA u savců. • Rostliny obsahují odlišnou formu nazvanou β-karbonátanhydratasa, která je z hlediska evoluce odlišný enzym, ale podílí se na stejné reakci a využívá atom zinku v aktivním místě. U rostlin je úkolem CA zvyšovat koncentraci CO2 v chloroplastech za účelem zvýšení rychlosti karboxylace katalyzované RuBisCem. Reakce fotosyntézy – RuBisCo využívá pouze CO2 a ne uhličitou kyselinu nebo hydrogenuhličitan.

  39. Mechanismus působení CA • Prosthetická skupina Zn 2+ v aktivním místě je koordinována třemi His. Čtvrtá koordinační pozice je obsazena molekulou vody. • Dochází k polarizaci vazby vodík – kyslík. Kyslík má negativní náboj a tím je vazba s vodíkem zeslabena. • Čtyři His kolem vody jako substrátu váží proton, což vede k k uvolnění hydroxidové skupiny vázané na Zn. Příklad acidobazické katalýzy. • Aktivní místo také obsahuje specifickou kapsu pro CO2 v těsné blízkosti hydroxidové skupiny. Na elektrony bohatý OH – se váže naoxid uhličity za tvorby hydrogenuhličitanu.

  40. Pozice Fe2+ v deoxyhemoglobinu.

  41. Vazba kyslíku vede ke strukturním změnám. Atom Fe je vtažen po vazbě kyslíku do roviny hemu. S ním je vtažen i proximální His.

  42. Konformační změny v hemoglobinu.Pohyb Fe2+ po vazbě kyslíku vtáhne do kruhu proximální His, který jako součást a helixu ovlivní svým C koncem vztah mezi ab páry vedoucí k dalším strukturním změnám. Porovnáni se strukturou deoxy (šedá).

  43. Přechod ze stavu T do stavu R u hemoglobinu.Po vazbě kyslíku na pár a1 b1 se a1 b1 pár pootočí vůči druhému a2 b2 páru o 15o.

  44. Posun mezi řetězci b2 a a1 hemoglobinu po vazbě kyslíku. Stavy R vázán kyslík a T bez kyslíku.

  45. Symetrický model allosterie. V jedné kvarterní struktuře nemohou existovat vedle sebe formy T a R.

  46. Sekvenční model allosterie. Ligand po vazbě na jednu podjednotku progresívně vyvolává konformační změny sousedních podjednotek.

  47. Síť iontových párů v deoxyhemoglobinu. C-koncové skupiny (Arg 141a a His 146b) v T stavu. Jsou vytvářeny intra a interjednotkové vazby. Energií vznikající vazbou O2 – Fe jsou vazby přerušeny.

  48. Síť iontových párů v deoxyhemoglobinu. C-koncové skupiny (Arg 141a a His 146b) v T stavu. Jsou vytvářeny intra a interjednotkové vazby. Energií vznikající vazbou O2 – Fe jsou vazby přerušeny.

More Related