Inżynieria genetyczna Zakład Cytogenetyki Molekularnej osoba prowadząca: dr inż. Andrzej Dybus

1. Inżynieria genetyczna Zakład Cytogenetyki Molekularnej osoba prowadząca: dr inż. Andrzej Dybus

2. Potencjalne zagrożenia w laboratorium • Zagrożenia zakaźne • podczas pracy należy „na wszelki wypadek" traktować każdy materiał biologiczny jako potencjalnie zakaźny (błędem jest dzielenie na bezpieczny i niebezpieczny) • materiał genetyczny obecny w próbce biologicznej zwykle nie jest niszczony wysoką temperaturą, a więc próbki zawierające mało białka można przed badaniem autoklawować (w praktyce prawie całkowicie likwiduje to ryzyko zakażenia) • jeżeli takie postępowanie jest niemożliwe (próbka ulega koagulacji cieplnej) wówczas opakowanie należy przenieść pod włączone dygestorium (założyć rękawiczki i gogle) i bardzo ostrożnie otworzyć (czasami bywa pod ciśnieniem i potrafi "siknąć"!) • wybrać część odpowiednią do badań, resztę zamknąć w zgrzanym foliowym worku i zamrozić do ewentualnej powtórki (po zakończonym badaniu spalić, wrzucić do wiadra z rozcieńczonym podchlorynem sodu albo, w przypadku materiału w najwyższym stopniu zakaźnego - zasypać wapnem chlorowanym) • przed izolacją kwasów nukleinowych z próbki często należy ją rozdrobnić, dobrze jest robić to za pomocą narzędzi jednorazowego użytku. Podczas izolacji materiału genetycznego z użyciem m.in. fenolu i etanolu, zakaźność materiału znika i praca z wyizolowanym materiałem genetycznym bakterii czy wirusów jest całkowicie bezpieczna

3. Potencjalne zagrożenia w laboratorium • Zagrożenia chemiczne • najpoważniejszym zagrożeniem jest praca z odczynnikami do wybarwiania kwasów nukleinowych (np. z bromkiem etydyny) • praktycznie każda substancja wiążąca się z DNA ma działanie muta- lub kancerogenne. Nie należy dopuszczać do kontaktu tych substancji ze skórą, wdychać pyłu lub oparów! • odczynnik fenolowy jest żrący, silnie korodujący mutagenny i trujący, a czysty gorący fenol używany do jego wytworzenia dodatkowo jest łatwopalny • podczas sporządzania odczynnika fenolowego i późniejszej z nim pracy należy zachować najwyższą ostrożność. Chloroform, używany komplementarnie z fenolem ma działanie onkogenne! • sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS, sodium dodecyl sulphate) jest bardzo silnym detergentem w dużym stężeniu rozpuszczającym błony komórkowe, zwłaszcza "cienkościennych" komórek nabłonka układu oddechowego • dodatkowo jest to substancja bardzo lekka, pylista i elektryzująca się (łatwo „odskakuje" od łopatki podczas nabierania). Unikać wdychania pyłu! W czasie ważenia zakładać maseczkę! • obecnie odczynniki chemiczne, zwłaszcza sprowadzane z zagranicy, są dobrze opisane. Należy czytać ulotki dołączone do odczynników, studiować napisy na opakowaniach, nauczyć się międzynarodowych znaków ostrzegawczych

4. Potencjalne zagrożenia w laboratorium • Zagrożenia fizyczne • najpoważniejsze do niedawna zagrożenie fizyczne w pracowni biologii molekularnej, czyli promieniowanie jonizujące izotopów radioaktywnych obecnie w praktyce prawie przestało istnieć • nie ma już konieczności stosowania izotopów, znakowania radioaktywne prawie całkowicie zostały wyparte przez nie radioaktywne (biotyną, antygenem lub enzymem) • izotopy są (i pewnie jeszcze długo będą) stosowane w „starych" laboratoriach, w których ciężko zarzucić rutynową, sprawdzoną technologię i przestawić się na nieradioaktywną • niedocenianym zagrożeniem jest promieniowanie UV, którego źródła w pracowni to lampy sterylizujące podsufitowe, w komorach laminarnych oraz transiluminatory • należy chronić całą twarz przesłoną (co najmniej oczy specjalnymi okularami), zakładać rękawiczki. Wietrzyć pracownię z nadmiaru tworzącego się pod wpływem UV ozonu! • pracownia biologii molekularnej to niezliczone mrowie aparatów podłączonych do sieci elektrycznej, co zwiększa możliwość porażenia prądem. Wskazane jest zastosowanie nowoczesnych instalacji elektrycznych; absolutne minimum to wszystkie gniazdka elektryczne w pracowni ze sprawnym zerowaniem (gniazdka z „kołkami")

5. Potencjalne zagrożenia w laboratorium • Fartuch laboratoryjny to nie fason ani moda. To nasza najważniejsza obrona przed zabrudzeniem odzieży chemikaliami i patogenami. • Ręce płuczemy dosłownie co chwila, ale mydła używamy tylko przed posiłkiem i przed wyjściem z pracy. • Jeżeli ktoś "nie może" myć rąk samą wodą, musi używać kremu natłuszczającego, bo odtłuszczona ludzka skóra to po prostu istne sito... • Pracujemy w rękawiczkach, to chroni nas przed badanym materiałem i ... badany materiał (zwłaszcza RNA) przed nami. • Wyciąg (dygestorium) jest po to, aby chronić pracownika. • Komora z laminarnym przepływem powietrza jest po to, aby chronić próbki (zwłaszcza podczas nastawiania testu PCR) przed pracownikiem (zanieczyszczenie). • Komora sterylna służy do bezpiecznej pracy z wyjątkowo niebezpiecznym materiałem, chroni więc "obie strony". • Źródło: http://www.forensic.am.wroc.pl

6. Wprowadzenie do technik klonowania • Inżynieria genetyczna - dziedzina genetyki zajmująca się wprowadzaniem do komórek biorcy ściśle zdefiniowanego odcinka DNA dawcy w celu wywołania trwałej zmiany właściwości biorcy. • Sposoby uzyskiwania komórek o zmienionym genotypie: • hybrydyzacja (fuzja) komórek (blisko spokrewnionych) • selekcja • mutageneza ukierunkowana połączona z selekcją • klonowanie molekularne • Klonowanie: uzyskanie klonu komórek (potomnych) pochodzących od jednej komórki (każda komórka klonu musi zawierać identyczny materiał genetyczny) poprzez posiew izolacyjny, selekcję, wyodrębnienie 1 komórki organizmu i jej namnożenie in vitro. • KLONOWANIE MOLEKULARNE: wprowadzenie do komórki obcego DNA w sposób umożliwiający jego namnożenie

7. Etapy klonowania molekularnego • Pozyskanie DNA do klonowania (insertu) • z genomowego DNA (PCR), za pośrednictwem mRNA (RT-PCR) • z plazmidów • chemiczna synteza (syntetyzer nukleotydów) • przypadkowa fragmentacja DNA („shot gun”): np. ultradźwięki, enzymy restrykcyjne • Trawienie insertu enzymem (-ami) restrykcyjnym • Trawienie DNA wektora • Łączenie fragmentów DNA insertu i wektora przy udziale ligazy (ligacja) • Wprowadzenie zrekombinowanych cząsteczek DNA do odpowiednio przygotowanych komórek biorcy (transformacja) • infekcja – zakażenie bakteriofagiem lub wirusem • transfekcja – wirusem bez otoczki, transdukcja – przy użyciu bakteriofaga, koniugacja • transformacja (chemiczna, liposomalna, elektryczna, mechaniczna)

10. Reakcja PCR (założenia ogólne) • PCR pozwala na uzyskanie więcej niż 10 mln kopii matrycy docelowej DNA z kilku kopii wyjściowych. Czułość tej metody oznacza, że próbki nie powinny być zanieczyszczone żadnym innym DNA albo wcześniej uzyskanymi amplikonami, które mogą znajdować się w środowisku laboratorium • Zapobieganie zanieczyszczeniom (kontaminacjom) • przygotowanie próbek DNA, mieszaniny reakcyjnej oraz przebieg reakcji PCR, i dodatkowo późniejsze analizy produktów reakcji, powinny być wykonywane w oddzielnych miejscach • do sporządzania mieszaniny reakcyjnej PCR zalecane jest posiadanie komory laminarnej wyposażonej w światło UV • do każdego etapu analizy powinno się zakładać nowe rękawiczki • użycie odpowiednich do reakcji PCR probówek cienkościennych i wysterylizowanych pipet lub końcówek z filtrem • odczynniki do PCR powinny być przygotowywane oddzielnie i używane wyłącznie do tego celu. Zalecane jest autoklawowanie wszystkich roztworów z wyjątkiem dNTPs, starterów i polimerazy • roztwory powinny być podzielone na małe porcje i przechowywane w wyznaczonych do tego rejonach zamrażarki • powinna być zawsze wykonywana reakcja kontrolna PCR, bez matrycowego DNA, aby potwierdzić brak zanieczyszczeń (kontaminacji)

11. Przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej PCR Aby wykonać identyczne reakcje, rekomenduje się przygotowanie mieszaniny głównej (ang. master mix) zawierającej wodę, bufor dla polimerazy, MgCl2, mieszaninę nukleotydów (dNTP), startery i polimerazę Taq w jednej probówce, która następnie może być podzielona do pojedynczych probówek. Matrycowe DNA różnicujące amplifikacje jest dodawane oddzielnie. Taka metoda ustawienia reakcji PCR minimalizuje możliwość błędów pipetowania i pozwala zaoszczędzić czas przez redukcję liczby „pipetowań” odczynników. Po rozmrożeniu wszystkich roztworów wymieszać je delikatnie i krótko zwirować, następnie umieścić na lodzie. Odczynniki dodawać według kolejności podanej w poniższej tabeli. Po dodaniu odczynników delikatnie wymieszać próbki i krótko zwirować, aby zebrać wszystkie krople ze ścianek probówki.

12. Protokół 1 Przygotowanie insertu DNA do klonowania (amplifikacja klonowanego genu) Sekwencje starterów Starter F:5’-CGCGAATTCACATATGTTATTGACTGGCAAATTAT-3’ (35nt) EcoRI Starter R:5’-CGCAAGCTTTTATTTTAAACTCTTTCTAAGCTG-3’ (33nt) HindIII Do termocyklera Perkin Elmer 2400 wprowadzić następujący profil termiczny: Profil termiczny PCR 1/ 94 ˚C 120s - wstępna denaturacja matryc 2/ 94 ˚C 30s – denaturacja 3/ 58 ˚C 30s – dołączanie starterów etapy 2/3/4 powtórzyć 30-krotnie 4/ 72 ˚C 60s – elongacja 5/ 72 ˚C 300s – wydłużanie końcowe Produkt PCR – amplikon długości 525 par zasad (pz)

13. Protokół 1: Przygotowanie insertu DNA do klonowania (amplifikacja klonowanego genu) • Składniki mieszaniny reakcyjnej dodawać zgodnie z kolejnością podaną w poniższej tabeli. • Mieszaninę PCR należy przygotować dla 5 prób (w probówce o pojemności 500 μl), wymieszać przez kilka sekund na wytrząsarce, zwirować (15 sekund/10000 obrotów). • Przenieść po 38,2μl mieszaniny PCR do cienkościennych probówek o pojemności 200μl. • Po przeniesieniu mieszaniny do probówek dodać po 1,8μl matrycy DNA. • Wymieszać ponownie przez kilka sekund na wytrząsarce, zwirować (15 sekund/10000 obrotów)