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Épidémiologie régionale du VHC A propos d’une nouvelle technique de génotypage

Épidémiologie régionale du VHC A propos d’une nouvelle technique de génotypage. Elise KRATTINGER Rhevir 2006. I.Généralités. VHC. VIH. 150 000. 35 000. 600 000. L’hépatite virale C…. Problème de santé publique Prévalence mondiale: 180 millions (3%) France: 600 000 personnes (1%)

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Épidémiologie régionale du VHC A propos d’une nouvelle technique de génotypage

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  1. Épidémiologie régionale du VHC A propos d’une nouvelle technique de génotypage Elise KRATTINGER Rhevir 2006

  2. I.Généralités

  3. VHC VIH 150 000 35 000 600 000 L’hépatite virale C… • Problème de santé publique • Prévalence mondiale: 180 millions (3%) • France: 600 000 personnes (1%) • 15-18 000 nouveaux cas/an • Chronicité: 80%, cirrhose: 20%, CHC: 4% • 1ère cause de transplantation hépatique en Europe • Mortalité: 3000/an • Prévalence VHC= 4 x HIV

  4. Transmission • Voie parentérale: • Transfusion sang et hémodérivés (1ère cause AVANT 1991) • Toxicomanie intraveineuse (1ère cause DEPUIS 1991) • Autres voies • Nosocomiale (3 à 10%): dialyse,chirurgie lourde, endoscopie avec biopsie • Professionnelle: 3 à 5% • Verticale: 5-10% (20% si VIH+) • Sexuelle ? peu probable… • Autres: piercing, tatouage, acupuncture, soins dentaires • Cas sporadiques (30%)

  5. Variabilité génétique • Caractéristique du VHC • Absence d’activité « proofreading» de l’ARN polymérase • Variabilité +/- marquée selon les régions • 5’NC, core  région conservée • NS5b, E1, E2 (domaine hypervariable HRV1) pression de sélection • Classification • Types : Homologie > 70% • Sous-types: homologie > 80% • Isolats: homologie > 90% • Concept de quasi-espèces 6 génotypes >70 sous-types

  6. Impact de la variabilité (1) • Association génotype et distribution géographique Mellor J et al, J Gen Virol, 1995 • 1,2,3 répartition ubiquitaire • 4,5,6 distribution localisée • Association génotype et mode de contamination Pawlotsky JM et al, J Infect Disease,1995 • 1b, 2 et 5  transfusion • 1a, 3 et 4  toxicomanie  Génotype = traceur épidémiologique

  7. Prévalence et distribution géographiques des types et sous-types du VHC

  8. Impact de la variabilité (2) • Association génotype et clinique • Génotype 1 plus sévère ?  controversé Fattovich G et al, J Viral Hepat, 2001 • Génotype 3 et stéatose  à préciser Rubbia-Brandt L et al, Histopathology, 2001 • Association génotype et thérapeutique/prévention Martinot-Peignoux M et al, Hepatology, 1995 • 2, 3  PegIFN-riba 24 sem  80% RVP • 1, 4  PegIFN-riba 48 sem  50% RVP • Hypothèse d’un vaccin illusoire… Génotype = marqueur pronostique

  9. II.Etude épidémiologique régionale 1993-2005

  10. Étude épidémiologique régionale • Objectif: épidémiologie descriptive VHC de 1993 à 2005 en Languedoc-Roussillon • Outil: Fiche épidémiologique réseau VHC • État civil: sexe, âge, origine géographique • Biologie: sérologie VHC, coinfection (VIH, VHB) • Virologie: ARN qualitatif, génotype, charge virale • Mode de contamination présumé, antécédents médicochirurgicaux • Traitement: naïf, répondeur, rechuteur

  11. Patients Juin 1993-décembre 2005 CH du réseau RHEVIR 9862 patients, 43 ans 4028 femmes (40,8%) 5834 hommes (59,2%) Prescripteurs Médecine: 43% Hépatologie: 30% Externes: 8.6% Chirurgie: 6.1% Psychiatrie: 3.8% Obstétrique: 3.7% Néphrologie: 2.7% Méd préventive: 1.4% Patients et prescripteurs

  12. Données biologiques • ARN +: 72% (n=6090) • Génotypage: 42% (n=4179) • Co-infections: 11% • VIH: 13% (n=842) • VHB: 8% (n=340)

  13. Génotypes et mode de contamination

  14. Génotypes et sexe/âge

  15. Tendances évolutives

  16. 63% (n=1094) Homme: 72%; 34 ans ARN + (71%) Génotype 3a (36%) 1a (23%) 4 (10%) Co-infections VIH (39%) VHB (25%) 18% (n=324) Femme: 58%; 51 ans ARN + (90%) Génotype 1b (38%) 3 (19,18%) 2 (16%) Co-infections VIH (8%) VHB (6%) Le toxicomane / Le transfusé

  17. Conclusions Contamination par voie parentérale: 82% Évolution des 2 endémies du VHC  Principal FR: Usage de drogues IV  Glissement génotypes 1b vers 3a  Conséquences cliniques et thérapeutiques Exposition nosocomiale et « Autres causes »: 18% Biais concernant le groupe « Non renseignés » Données méconnues, perdues, oubliées… Groupe hétérogène

  18. III. Etude d’une nouvelle technique de génotypage

  19. Techniques de génotypage • Actuellement… • Séquençage région 5’ NC ou NS5b/E1 (technique de référence): TRUGENE® (Bayer) • Hybridation moléculaire: LIPA HCV II® (Bayer) • Récemment… • Typage par PCR temps réel (région 5’NC)

  20. Applications • Objectifs: • Projet de typage régional VHC • Mise au point technique (I.Dorval, 2004) • Validation au CHU Montpellier • Patients: n= 208 patients « nouveaux VHC + » en 2005 • Méthodes: • Analyse courbes de fusion post-PCR temps réel Light Cycler (Roche®) • Comparaison au LIPA • Séquençage des souches discordantes

  21. Hybridation sur membrane

  22. Extraction ARN viral sur colonne RT-PCR en temps réel (sondes d’hybridation) Courbe de fusion Typage sur Light Cycler

  23. Sondes d‘hybridation F1 F2 Amorce Sens 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Amorce anti-sens Principe des sondes d’hybridation Sonde Anchor séquence conservée commune à tous les génotypes Sonde Sensor séquence spécifique de chaque génotype

  24. Typage avec sondes d’hybridation t° désappariement= f(homologie sonde/séquence)

  25. RT-PCR • Fluo= f(n cycle) 2.Courbe de fusion Dénaturation de l’ADN par  t° 3.(-dF/dT)/T°C Tm= 50% brins dissociés 1 génotype = 1 Tm

  26. Résultats (1)

  27. Résultats (2)

  28. Résultats (3)  Concordance: 97,1%

  29. Résultats (4) Analyse des souches discordantes

  30. Discussion (1): région étudiée • Région 5’NC • Région la plus utilisée pour le typage • Mais… -Moins adaptée pour certains types (2 et 4) -Mutations de polymorphismes mésappariement sondes/séquence virale  erreurs de typage ? • Infections mixtes • Détection  population amplifiée > 25% • Sous-estimation avec méthodes PCR ?

  31. G3 52,66° G4 55,89° G2 60,45° G1 64,01° Tm (°) 60 G5 60,10° 50 55 65 Discussion (2): design des sondes • Génotype 1=6, Génotype 2=5 • Sous typage impossible  aucun intérêt clinique • Sondes spécifiques du génotype 1

  32. Discussion (3): formats de fluorescence • SYBRGreen: simple, peu coûteux mais manque de spécificité • Takemura et al, Rinsho Byori, 2004 • Fujigaki H et al, Ann Clin Biochem, 2004 • Sondes Taqman: bons résultats mais multiplication sondes, mix, coût • Lindh M et al, Journal of Clinical Virology, 2005 • Rolfe KJ et al. J Clin Virol, 2005 • Moghaddam, A. Journal of Viral Hepatitis, 2006 • Sondes d’hybridation  pistes optimisation • 1 couple de sondes: • Haverstick, DM, Clinical Chemistry, 2004 • 3 couples de sondes et 2 canaux de fluorescence • Schroter M et al, Journal of clinical microbiology. 2002

  33. Conclusions… • Typage 88% des génotypes locaux (1, 3 et 4) • Avantages des techniques « en temps-réel » • Pas de manipulation post-PCR • Rapide, coût  • Limites: • Génotypes 2 et 5 (12% des génotypes locaux et pronostic différents) • Quantification + typage oui mais…pour génotype 1 • Agrément CE • Mais…optimisation technique possible: •  nb couples de sondes, sondes MGB •  canaux de fluorescence

  34. Et perspectives… Typage en routine au laboratoire Application pour les PVD ?

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