1. Cancer du seinStatut HER2 et IHCL’importance de la phase technique

2. Détermination du statut HER2 par IHC et FISH/CISH

3. Oncogène HER2, chr 17q1-2 Surexpression de la protéine Activation par amplification

4. Tumeurs HER2 (+++)

5. Détermination du statut de HER2/neu Hybridation in situ en fluorescence (FISH)et Chromogenic in situ hybridization (CISH) : amplification du gène Immunohistochimie (IHC) : expression de la protéine

6. Les cellules tumorales des cancers du sein Nombre de chromosomes anormaux +++( aneuploïdie) Dr AURIAS, Institut Curie, Paris HER-2: 17q21.1

7. Sur-représentation d’HER-2 • des polysomies 17 • des translocations déséquilibrées du 17q 6 copies de HER2 Dr COUTURIER, Institut Curie, Paris Translocation déséquilibrée 17q

8. Est-ce que le statut HER2 est stable,ou peut être acquis au cours del’évolution tumorale ? Travail de Meng S PNAS 2004

9. Meng S, PNAS 2004 • Etude sur 33 patientes stade I à IV • Comparaison de l’amplification HER2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive • Puis même étude sur 24 patientes HER2 -

10. Etude initiale sur 33 patientes HER2- • Le statut HER2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). • Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; • Pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou Herceptin avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER2 positives.

11. 2ème étude sur24 patientes HER2- • Evaluation sur CTC chez 24 patientes initialement HER2 « négatives » et en rechute • 9 ont acquis un statut HER2 « positif » lors de la progression • Les 9 patientes ont alors reçu Herceptin® 2RP et une RC

12. Critiques de l’étude • Les niveaux d’amplification (rapport HER2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. • Ceci est assez troublant car l’amplification génique est un phénomène stable. • Pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux d’amplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale ? • Pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de l’ordre de 2.2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification).

13. Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux d’amplification si bas ? • Plusieurs hypothèses se discutent : • Le statut HER2 n’a pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) • La CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER2, ce qui expliquerait ces valeurs limites d’amplification  • La cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER2, par sélection d’un clone HER2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale

14. Conclusion Si ces résultats sont confirmés,il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale,au niveau des métastases

15. Amplification  Surexpression x10 • Cible des traitements anti HER-2 = protéine HER-2 exprimée à un haut niveau (IHC 3+) • Surexpression à haut niveau d'HER-2 (3+) = liée à l'amplification du gène • Les surreprésentations donnent des hyperexpressions de faible niveau Leur réponse au traitement n'est pas connue  Objectif : détection des hyperexpressions/amplifications vraies

16. Détermination du statut HER-2par FISH • Technique idéale ‘’gold-standard’’ : - reproductibilité > à l'IHC - échecs identifiables (fixation BOUIN ++) - résultat sous forme d'une variable discontinue (numérique) • Plusieurs limitations : - investissement en microscopie en fluorescence - coût plus élevé que l'IHC (210 €) - nécessité d'un personnel entrainé - fixation FORMOL ou Formol-Ac Acétique • Indications : - calibration de l'IHC - détermination du statut des IHC 2+

17. Hybridation in situprincipe • Visualisation in situ du nombre de copies d'un gène • Sur coupe à partir de tissu congelé, ou fixé • Lecture en référence à l'histologie, • identification des structures invasives • intérêt par rapport aux méthodes moléculaires +++ • La sonde visualisée soit par l'intermédiaire . d'un fluorochrome (FISH) technique de référence . d'un chromogène (CISH)

18. FISH HER-2 • 2 types de kits approuvés FDA - sonde HER-2 seule (Oncor/Ventana; Zymed)  n. de copies HER-2 - sonde HER-2 + cent 17 (Vysis/Abott; Dako, …)  rapport copies HER-2 / copies cent 17 Un impératif : distinguer les amplifications des sur-représentations

19. FISH HER-2 amplifications sur-représentations >10copies centromère 17 HER-2 6 copies HER-2 cent 17

20. FISH HER-2 recommandations - HER-2 : > 6 copies - HER2/cent 17 : > 2.2 * • Les amas de signaux (hsr) signent les amplifications. • Donner les nombres de signaux HER-2 • Vérifier HER-2/cent 17 en cas de 6-7 copies HER-2 • Archiver les images (contrôle de qualité) Recommandation : afin de ne détecter que les amplifications vraies  seuil ratio HER2/Cent 17 > 3 *ASCO 2006, recommandations JCO

21. Cas non amplifiés CISH Dr ARNOULD, Dijon 2 spots 5 spots

22. Cas avec amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon

23. Faible amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon 6 spots Vérification par FISH du centromère du chr 17

24. Immunohistochimie : avantages • Visualisation de la protéine in situ • spécificité de l’évaluation de la surexpression • quantification de la protéine cible • Largement répandue • Sensible • Automatisable et standardisable • Faible coût • Polyclonaux (A0485, Herceptest®), monoclonaux (CB11, PathwayTM de Ventana, SP3 de lapin …)

25. Cas (++) Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène

26. Cas (+++) Fort niveau d’amplification > 15 copies du gène

27. IHC : inconvénients • Grande sensibilité • Fixation inadéquate : altération des antigènes • Pas de seuil de positivité consensus

28. Concordance statut HER2 FISH et IHC Si… • immunohistochimie calibrée • nombre de cas testés par an suffisant 90%

29. « Discordances » FISH / IHC < 10% • amplification sans surexpression • surexpression sans amplification

30. 65 à 80% des cas Pas d’amplification Pas de surexpression

31. 15% à 30% des cas +++ Fort niveau d’amplification Surexpression forte

32. Surexpression modérée ++ 5% des cas dont : 40% Faible niveau d’amplification 60% Pas d’amplification

33. Herceptest® (Dako) • Anticorps primaire polyclonal ( A0485) • Sur tissus fixés en FORMOL neutre tamponné • Réactifs prêts à l’emploi • Témoins : lignées cellulaires, nombre déterminé de copies HER2/neu • Système de lecture standardisée

34. Comparaison Herceptest® / FISH Jacobs : J Clin Oncol, 1999, 17, 1974 - 82 Pauletti :J Clin Oncol, 2000, 18, 3651- 64 Lebeau : J Clin Oncol, 2001, 19, 354 - 63 Tubbs : J Clin Oncol, 2001, 19, 2714 -21 Perez : Mayo Clin Proc, 2002, 77, 148-154 Dowsett : J Pathol, 2003, 199, 418-423 Ainsworth : J Clin Path 2005, 58, 1086-1090 • positivité faible (++) : 6 à 87 % de faux positifs • positivité forte (+++) : 6 à 25 % de faux positifs Peut être une trop grande sensibilité mais la dernière version du kit donne de très bons résultats • dans le respect strict des conditions de fixation non alcoolique, • l’utilisation de témoins externes issus du laboratoire et dont le niveau d’amplification a été préalablement analysé • l’apprentissage de l’interprétation

35. Recommandations pour calibrer l’IHC sur la FISH et maintenir la concordance entre les 2 techniques Arch Pathol Lab Med, 2003, 127, p 549Modern Path, 2003, 16, p 173Histopathology, 2003,42, p 337

36. Conditions de fixation, préparation des coupes • Fixation optimale • en FORMOL neutre tamponné • moins d’1h après la résection chirurgicale • moins de 48h • fragment de 0.5 à 1cm d ’épaisseur • Préparation des blocs et coupes • conservation des blocs de paraffine à 20 à 25°C • réalisation des coupes idéalement moins d’une semaine avant à 20- 25°C • au maximum 4 à 6 semaines avant la technique d’immunohistochimie à condition d’un stockage à 4°C • 3 à 5µm d’épaisseur

37. Calibration de la technique • Conditions de réaction calibrées sur • FISH • témoins • lignées cellulaires • pH du tampon de pré-traitement (pH : 6) • Choix de l’anticorps : monoclonal ou polyclonal • Dilution de l’anticorps primaire • CB11 : 1/500 à 1/800 • A0485 : 1/500 pour le formol • 1/400 pour l’AFA Adapter la dilution à chaque changement de technique, y compris entre deux automates identiques mais plus ou moins neufs (expérience de Claudius Regaud, Toulouse)

38. Témoins • Utilisation de contrôles : • lignées cellulaires, fixées comme le tissu analysé • bloc multi-tissulaire (0, ++, +++) : nombre de copies connues par FISH • Bloc choisi avec tissu normal, en évitant le tissu décalcifié • Faux négatifs rares si pré-traitement par la chaleur

39. Glandes normales : témoin interne négatif de réaction Augmenter la dilution de l’anticorps primaire si marquage des glandes normal

40. Maladie de PAGET témoin positif de réaction Fort niveau d’amplification Surexpression forte +++

41. Témoin (++) amplifié (témoin intermédiaire très utile) • À obtenir auprès d’un centre expert FISH • Sur un des cas du laboratoire (condition de fixation et préparation des blocs identiques aux cas à tester )

42. Calibrage de l’immunohistochimieContrôle de qualité interne (1) • Pas de marquage des glandes normales • Coupe d’un bloc multi-tissulaire inclus à chaque manipulation : • forte amplification (forte surexpression) • amplification modérée (intensité modérée) • pas d’amplification (pas de marquage)

43. Calibrage de l’immunohistochimiecontrôle de qualité interne (2) • Fréquence des cas positifs : 15 à 30% • Retester 5% des cas positifs et négatifs / an • CURIE en 2005: • 24 cas 3+: 100% concordance avec la FISH • 4 cas 8 copies HER2 • 18 cas > 10copies • 2 cas NI • 19 cas négatifs 100% concordance avec la FISH

44. En cas de surexpression de HER2 sur la tumeur primaire Tumeur primaire Métastase HER2+++ bronchique médullaire

45. HER2 et récepteurs hormonauxcorrélation inverse • Lal et al Am J Clin Pathol 2005 • Koneckny JNCI 2003 • Taucher et al Cancer 2003 • Huang et al, Annals of Oncology , 2005

46. Calibrage de l’immunohistochimie contrôle de qualité externe : • Résultats à vérifier par FISH / CISH • Entraînement et formation du personnel • Tests nationaux (AFAQAP) 1 test / an européen (UK NEQAS) 4 tests / an

47. Indications de la détermination du statut de HER2 • En 2007, idéalement : • au diagnostic initial de carcinome infiltrant (ASCP 2006) !! • Ou bien : • Patientes métastatiques • N+ • N- avec critères de prescription de chimiothérapie adjuvante et/ou d’hormonothérapie adjuvante

48. En pratique • Regrouper les manipulations • Validation • vérification de la conformité des témoins externes, • détermination du niveau de l’intensité de la manipulation du jour ++++ • Interprétation des cas par le médecin ayant signé le diagnostic.

49. Interprétations • Prendre en compte • Le marquage membranaire • Le % de cellules carcinomateuses infiltrantes • L’intensité du marquage • Pas de seuil validé sur la réponse au traitement

50. Le score Score Marquage Indication Herceptin