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植物 DNA 分子标记 中国农业大学，郭仰东

植物 DNA 分子标记 中国农业大学，郭仰东. 分子标记的概念 广义的分子标记 （ molecular marker ）：可遗传的并可检测的 DNA 序列或蛋白。包括 蛋白质标记 和 DNA 标记 （狭义的分子标记）。 蛋白质标记包括动 植物蛋白 、 同工酶 及 等位酶. 理想的分子标记： 1. 高多态性 2. 共显性遗传 * 3. 能明确辨别等位基因 4. 遍布整个基因组 5. 无基因多效性 ** 6. 检测手段简单快速

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植物 DNA 分子标记 中国农业大学，郭仰东

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  1. 植物DNA 分子标记 中国农业大学，郭仰东

  2. 分子标记的概念 广义的分子标记（molecular marker）：可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包括蛋白质标记和DNA标记（狭义的分子标记）。 蛋白质标记包括动植物蛋白、同工酶及 等位酶

  3. 理想的分子标记： 1.高多态性 2.共显性遗传 * 3.能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组 5.无基因多效性 ** 6.检测手段简单快速 7.成本低廉 8.重复性好 * 杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，称为共显性（codominance） ** 基因多效性（gene pleiotropism）：一个基因产生多种表型效应的现象。

  4. DNA分子标记 DNA分子标记（DNA molecular marker）直接在DNA分子水平上检测生物间的差异，是DNA水平上遗传变异的直接反应。

  5. 随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

  6. DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，分为非PCR依赖的分子标记(基于Southern 杂交技术的分子标记)和PCR依赖的分子标记。

  7. 非PCR依赖的分子标记 • (基于Southern 杂交技术的分子标记)包括： • 限制性片段长度多态性标记 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） • 原位杂交（in situ hybridization）

  8. PCR依赖的分子标记： • 随机扩增多态性DNA标记 （random amplification polymorphism DNA, RAPD） • DNA扩增指纹印记 （DNA amplification fingerprinting, DAF） • 简单序列重复标记（simple sequence repeat, SSR） • 随机引物聚合酶链式反应 （arbitrarily primed PCR, AP-PCR） • 扩增片段长度多态性标记 （amplified fragment length polymorphism, AFLP）

  9. 基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。　 分子杂交：由具有互补碱基顺序的任何两条单链核酸分子片断形成双链的过程。

  10. 染色体原位杂交 是指DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子技术，其原理是两条核苷酸单链片断在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA双键分子，用带有标记的DNA或者RNA片断作为核酸探针，与细胞内染色体杂交，用放射自显影等方法予以显示，在荧光显微镜下观察目的mRNA或者DNA的存在与定位。

  11. In situ hybridization • For in situ hybridization, a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe, excess probe is washed away and the location of hybridized probe is examined. • The technique enables the spatial localization of gene expression to be determined as well as the location of individual genes on chromosomes.

  12. Fig. 5 GISH images of chromosomes of tetraploid and diploid Festulolium progenies. The DNA of L. perenne was used as probe, and shown as blue color. The chromosomes of F. pratensis were shown as pale blue color. Translocation breakpoints are indicated in a and c by arrows. (a) Bx350-184, a 28-chromosome genome with at least 14 intergeneric translocations, some of which have two breakpoints in an arm (arrows). Bar: 10 μm. (b) Bx351-160, a 28-chromosome genome with intergeneric translocations. Bar: 20 μm. (c) Bx350-177 with fertile pollen, a 28-chromosome genome comprising approximately equal amount of Lolium and Festuca DNA with 9 intergeneric translocations, some of which have two breakpoints in an arm (arrows). Bar: 20 μm. (d) Prior-57, a 14-chromosome genome with intergeneric translocations. Bar: 10 μm. Guo et al. 2005 a b c d

  13. RFLP标记：限制性片段长度多态性 RFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所产生的DNA片段在长度上的变化。 包括基因组DNA限制性酶切，Southern印记，DNA探针制备，同位素/非同位素标记，DNA分子杂交等步骤。

  14. 生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。生物能快速、精确地复制自身的DNA，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的DNA序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的。

  15. 限制性内切酶酶解DNA长链，是识别DNA上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对越少，DNA分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。

  16. 来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。

  17. 用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。 进行Southern印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的DNA杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核DNA的RFLP。

  18. 0.4kb 0.1kb 0.2kb 0.5kb (1) 0.4kb 0.3kb 0.5kb (2) × 品系1 品系2 – 0.5kb 0.4kb 0.3kb 0.2kb 0.1kb +

  19. RFLP标记方法与步骤 （1）DNA的分离：可用CTAB法或SDS法 （2）酶切：一般根据基因组总DNA的复杂性选 用限制酶。 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）Southern印迹转移 （5）DNA杂交及放射自显影

  20. RFLP标记优点 （1）不受性别、年龄局限，不会受表达的组 织、发育阶段或外界环境的不同而受影 （2）标记座位的等位基因间是共显性的，通过 杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性 纯合子 （3）RFLP标记源于基因组DNA自身变异，在 数量上几乎不受限制。

  21. RFLP标记缺点 （1）DNA需要量大。 （2）所需仪器较多 （3）技术较为复杂 （4）多数RFLP表现为二态性，提供的信息量较低 （5）与内切酶选用密切相关

  22. RAPD标记 1990年，美国杜邦公司科学家Williams推出。 RAPD方法是在PCR技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为10个核苷酸），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，引物与基因组DNA某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游DNA进行合成，即扩增。

  23. RAPD的基本概念和原理 RAPD的引物： （1）为随机引物 （2）序列较短（通常为10个核苷酸） （3）为一个寡核苷酸单链引物

  24. 品系1 品系2 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb ×

  25. RAPD的基本实验程序 1. DNA的提取 2. 模板DNA浓度和质量的检测 3. PCR扩增 4. 电泳检测：PCR结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液，每个泳道点样20ul。 5. 将凝胶浸于1ug/ml的EB中30min~60min，用水清洗约10min，观察、拍照。 6. 统计分析：记录条带清晰的RAPD条带，计算带纹相似率；计算带频率、群内遗传纯度；DNA片段大小。

  26. RAPD结果 Timothy genetic variation (Guo et al. 2002)

  27. Bojinek LV Bojinek LS Vati 7702 Mari Posa Bodin Vati 7701 Grinstad Engomo Kampe II Kiritappu Sv A 0918 Adda Tammisto Zolis Comtal Saga Sv A 0896 Erecta Rvp Iki Tuukka Alma Topas Drummond Farol Liglory Lirocco Liphlea Heidemij Glenmore Ligntasso Barmidi Kumpu Nosappu Hokushu Phlewiola Winmore Akkeshi Foka Figure 5a. Combination of RAPD and UP-PCR binary matrices analysis of UPGMA dendrogram illustrating genetic relationships among the 38 timothy populations based on similarity (DICE) coefficient. Mainly Northern Europe Germany, Canada and Japan 0.7 0.8 0.9 1.0

  28. RAPD的优缺点 优点： （1）不需DNA探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖整个基因组。具有广泛适用性和通用性。 （2）用一个引物可扩增出多片段。 （3）技术简单，需要样品量少，成本低。 （4）每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点，简化信息的转移过程。 （5）可以对RFLP难以分析的基因组区域做遗传连锁图。 （6）分析自动化。

  29. RAPD的优缺点 缺点： （1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。 （2）对反应条件敏感，重复性差。模板浓度、 Mg 2+浓度，PCR反应中条件的变化等。 （3）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段 不一定同源；一条带可能包含不同的产物。

  30. AFLP标记 • AFLP：扩增片段长度多态性 （amplified fragment length polymorphism） • AFLP技术是1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau Mare和Vos Pieter发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。

  31. AFLP的基本原理 植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增，最后通过PAGE分离扩增的特异限制性片段。在不需要DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。

  32. AFLP的基本原理 AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为18~20个核苷酸。引物主要由3部分组成： （1）核心序列（CORE），该序列与人工接头互补； （2）限制性内切酶识别特异序列（ENZ）； （3）选择性延伸序列（EXT），即引物3端的选择碱 基，选择碱基延伸到酶切片段区。

  33. CORE ENZ EXT EcoRI 5 ´ -GACTGCGTACC AATTC NNN-3 ´ MseI 5 ´ -GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3´ 如：EcoRI引物和MseI引物

  34. AFLP的优缺点 • 优点： （1）少量引物可获得较多标记，50~150条带 （2）多为显性标记或共显性标记，受环境影响 小，无复等位效应 （3）带型清晰，具高分别率 （4）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带纹丰富，灵敏度高，重复性好 （5）不需事先知道DNA序列信息 • 缺点：操作复杂，费用较高

  35. SSR标记 • SSR：简单重复序列（simple sequence repeat）多态性，也叫微卫星标记。 • 微卫星：即短串联重复(Short  Tandem  Repeat，STR)，它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常多态性片段长度在100-300bp。以人类基因组为例，平均每15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约有50,000-100,000个STR位点。由于微卫星DNA具有高度的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学DNA分子标记。

  36. 真核生物基因组中散布着大量的微卫星DNA，微卫星DNA由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为2~6bp，一个SSR总长度可达几十到几百bp。许多微卫星间的不等交换或复制过程中的DNA滑动而高度可变，因而显示出了丰富的限制性片段多态性。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列两端往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就可检测到简单重复序列单位数不同的DNA区域多态性。真核生物基因组中散布着大量的微卫星DNA，微卫星DNA由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为2~6bp，一个SSR总长度可达几十到几百bp。许多微卫星间的不等交换或复制过程中的DNA滑动而高度可变，因而显示出了丰富的限制性片段多态性。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列两端往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就可检测到简单重复序列单位数不同的DNA区域多态性。

  37. Tomosakae (parental line) 241 (2n) 229 (2n) 200 (2n) 231 (2n) 217 (2n) 238 (2n) 175 (4n) 214 (4n) 185 (4n) 184 (4n) 267 (4n) 12 (parental line) Bx 351 (wt, 4n) - - - - - - - - - - - Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 Bx 351 - NC D bp 250 150 105 Fig. 6 SSR profiles of Festulolium progenies with primer LPSSR K10F08 showed amplified polymorphism among the diploid and tetraploid Festulolium progenies and showed two tetraploid-specific band of 110 bp and 115 bp (arrows) which also appeared in the amphidiploid Festulolium wild type plant (2n=4x=28) and putative parental D-12 (Lolium perenne) plant, respectively. NC, negative control.

  38. 标记系统在应用时的选择

  39. 分子标记的应用 • 分子标记遗传图谱的构建和基因定位 • 分子标记对质量性状的基因定位 • 数量性状基因位点（QTL）分子标记对定位的研究 • 分子标记辅助选择育种 • 比较基因组分析 • 分子标记用于种质鉴定的研究

  40. Southern 杂交是分子生物学的经典试验方法。 其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。 1973，英国爱丁堡大学的Southern教授发明

  41. Northern杂交是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信息在不同样品中的表达丰度的首选方法。Northern杂交是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信息在不同样品中的表达丰度的首选方法。 Northern杂交可以选用放射性同位素标记或地高辛（DIG）和生物素（BIOTIN）标记的RNA探针或DNA探针。 Northern杂交由斯坦福大学的George Stark教授于1975年发明。

  42. Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白。

  43. 基因芯片技术和应用 概念：采用原位合成或直接点样的方法将大量DNA片段或寡核苷酸片段以预先设计的方式排列在硅片、玻璃等介质上形成微矩阵，待检测样品用荧光分子标记后，与微矩阵杂交，通过荧光扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。

  44. 基因芯片

  45. 基因芯片技术和应用 • 按载体材料分：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片 • 按点样方式分：原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片 • 按DNA种类分：寡核苷酸芯片、cDNA芯片 • 按用途分：表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片和毒理芯片等。

  46. 基因芯片技术和应用 • 实验操作： • 准备探针：RNA提取→标记→荧光染料 • 杂交反应 • 杂交后的处理 • 实验设计：异种DNA平行试验；RNA质量 检测对照；封闭对照；规整化对照 • 成像分析

  47. Gene chip

  48. 基因芯片技术和应用 • 基因芯片的应用： 基础医学研究；药物筛选；临床诊断；指导用药；预防医学研究；环境保护；军事、司法；农业等 • 基因芯片使用应注意的问题： 类型的选择；基因芯片数量；取材；取材量；结果分析；多种芯片结合应用

  49. 电泳技术

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