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INTRODUCTION. Les Micro ARNs : Large classe d'ARN non codant pr
E N D
1. Les Micro ARNs rgulent lexpression de lepissage alternatif du facteur nPTB durant le dveloppement musculaire KHALLADI Hayate
NOUAR Roqiya
2. INTRODUCTION Les Micro ARNs :
Large classe dARN non codant prsent dans divers organismes .
Chez les mammifres , une centaine de micro ARNs ont ts identifis , beaucoup dentre eux sont tissu spcifique .
Ils sont temporairement rguls dans leurs expression , mais leurs fonctions biologiques sont pas encore connue .
3. INTRODUCTION Epissage des ARNm :
Mcanisme par lequel les pr-ARNm perdent leurs squences introniques et ne conservent que leurs squences exoniques la fin de la transcription .
Cest une des tapes de maturation des ARNm .
Cest un moyen de rgulation post-transcriptionnel des gnes qui contribue la diversification de protines produites dans diffrents types cellulaires .
De multiples Myopathies sont causes par une altration de lpissage alternatif .
4. INTRODUCTION Les facteurs PTB :
Deux rgulateurs sont connu pour contrler lpissage alternatif durant la diffrenciation neuronale et musculaire :
-la polypyrimidine tract-binding (PTB)
-et son homologue neuronale (nPTB )
5. INTRODUCTION Ce quils vont essayer de montrer :
6. 1)Les protines nPTB sont prsentent dans les cellules C2 C12 myoblastiques mais sont absentes des myotubes diffrencis : On a bien formation et maturation des myotubes lors de la phase de diffrentiation
7. On immunoblot des protines issuent du lysat cellulaire C2 C12 en utisant :
-AC anPTB IS 2 (1 , 2)
-AC aptb NT AC (3,4 )
Bien que prsentent dans la prolifration des myoblastes , les protines n PTB sont limins dans les myotubes diffrencis et diminus pour PTB .
IL est donc par consquent probable que ces deux paralogues expriment des motifs diffrent
8. Ceci confirme que la perte de n PTB et la diminution de PTB concide avec le dbut de la diffrentiation musculaire
Mais que pour n PTB une correspondance de son ARNm na pas lieu .
Donc il est probable quil ait un mcanisme de rpression de la traduction des ARNm de n PTB
9. 2) n PTB contient des MREs (Micro ARN Reponse elements ) conservs de manire phylogntique pour miR-133 : Donc les n PTB possdent bien des MREs conservs pour les micro ARNs : miR 133 et miR 1/206 .
La rgion seed dhybridation qui fait intervenir miR 1/206 est plus faible que celles faisant intervenir miR 133
10. Ceci suggre que chaque paire de miR -133 et miR 1/206 sont coexprims partir dun precurseur transcript commun .
Donc les PTB et les n PTB sont les cibles des micro ARNs .
11. Lexpression de mir-133 et de mir-1/206 est restreinte aux lignes cellulaires du muscle .
12. Lvolution similaire des deux micro ARNs lors de la diffrentiation confirme bien quils ont un prcurseur commun .
13. 3) miR-133 rprime la traduction de lARNm de nPTB travers deux domaines MREs conservs dans lextrmit 3UTR Construction dun micro ARN artificiel semblable au miR-133 sauvage, et dune version mutante de miR-133 portant des points de mutations qui peuvent dsorganiser lappariement avec la rgion seed (contenant les MREs)
Transfection de ces micro ARNs dans les myoblastes en prolifration
Mesure de lexpression de nPTB
14. Diminution de 50% de nPTB pour le miR-133 sauvage
Pour miR-133 mutant, on a une trs faible diminution de lexpression de nPTB ? cette faible rpression est due peut-tre la possibilit dappariement avec les bases restantes non mutes
15. Pour tester directement si miR-133 peut rprimer la traduction travers la liaison des MREs de n PTB ? utilisation dun gne rapporteur (celui de la lucifrase) auquel on ajoute la squence 3UTR entire de la nPTB humaine, ou alors une version mute de la squence 3UTR sur 2 MREs.
Cette version mute restaure lappariement avec la version mute de miR-133
16. Utilisation de cellules HEK 293 (nexprimant pas miR-133 et miR-1/206)
Co-transfection dans ces cellules des gnes rapporteurs avec chaque micro ANR artificiel.
Mesure de lexpression de la lucifrase
17. 4)Le blocage de la fonction de miR-133 durant la diffrenciation de la cellule musculaire augmente lexpression des protines PTB et nPTB, et altre lpissage des exons spcifiques au muscle Utilisation doligonuclotides LNA complmentaires aux micro ARNs ? blocage de leur fonction
Immunoblot:
(1) Culture de cellules C2C12 sans milieu de diffrentiation
(2) Cellules C2C12 ayant pouss dans un milieu de diffrenciation durant 72h
(3 5) Cellules C2C12 ayant pouss dans un milieu de diffrenciation et transfectes avec diffrents LNAs
18. Evaluation quantitative des changements dexpression de nPTB induits par les diffrents traitements LNA
Normalisation du signal de fluorescence mis par lAc spcifique de nPTB
19. Rcapitulatif: n PTB prsente dans les myoblastes (cellules indiffrencies)
n PTB absente dans les myotubes (cellules diffrencies)
miR-133 rprime lexpression de nPTB durant la diffrenciation des myoblastes
n PTB rprime linclusion dans lARNm mature de certains exons
Si on bloque miR-133, on augmente lexpression de nPTB
20. On va tudier linclusion des exons suivants:
- NCAM1
- ITGA7
- CAPN3 exon 6
- MTMR1
- MEF2A exon
On analyse par RT-PCR les lysats des cellules dcrites dans la figure 5 (cellules traites avec diffrents LNA)
21. Confirme ce qui a t vu avant:
Si bloque lexpression de n PTB/PTB, on augmente linclusion des exons rprims par ces protines PTB
Si on bloque la fonction des miR-133, on diminue linclusion dans lARNm mature de ces exons nPTB dpendants
22. CONCLUSION : Les micro-ARNs peuvent cibler des gnes dont lexpression peut tre inadquate dans un tissu particulier , ou encore des gnes ncessaires dans le tissu mais qui doivent tre temporellement contrl durant le dveloppement (comme n PTB ) .
Ainsi , mir-133 joue un rle cl dans le contrle de lpissage alternatif durant la formation du muscle et la dfinition des proprits des cellules musculaires diffrencies .
23. CONCLUSION : Lexpression de n PTB est extrmement sensible la squence de 3UTR .
Durant ces expriences on a utilis la squence n PTB 3UTR entire dans la formation du gne rapporteur , plutt que des lments ou fragments isoles ?
Conservation du contexte structurale des domaines MREs dans lARN?
IL est probable que le silencing caus par les mi RNA soit coupl dautres mcanismes rgulant lexpression gntique .
24. CONCLUSION : miR-133 et mir-1/206 sont fortement conservs travers les espces animales .
156 gnes cibles conservs des miR-133 et miR-1/206 .
Parmi ces cibles conserves , peu de gnes dans les voies de dtermination du devenir cellulaire .
Beaucoup de ces cibles sont de nature structurale ou mtabolique ou encore des molcules de signalisation qui agissent aprs spcification du type cellulaire
Ces rsultats suggrent que ces micro ARNs contrlent lexpression lintrieur dune ligne cellulaire tablie plutt que linduction de la ligne.