Techniques d’études et d’identification microbiennes

1. Étude microscopique Utilisation microscope ou sur les colonies : œil nu, loupe ou loupe binoculaire Forme et structure de l’individu, mode de multiplication Préparation à l’état frais puis observation x10 et x40  bactéries, levures ou champignons filamenteux Bactéries : mise en évidence de mobilité Levures et moisissures : morphologie et taille des cellules; sexualité et parasexualité Techniques d’études et d’identification microbiennes Micro-organismes isolés Techniques nombreuses, variables en fonction du germe étudié : levure, moisissure, bactérie Identification par caractères morphologiques, culturaux, biochimiques, physiologiques, sexuels, immunologiques, lysotopiques et de pathogénicité Bactéries : coloration de gram ou d’éléments cellulaires : spores, capsules, cils, inclusions

2. Étude biochimique et physiologique Caractère culturaux Milieux liquides : détermination de la zone de culture (surface ou profondeur), aspect général (en particulier sa surface) Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude microscopique Mensuration des micro-organismes Utilisation de micromètres oculaire et objectif sur un microscope Géloses inclinées : aspect et forme de la culture, consistance et couleur Boite de Pétri (colonies séparées) : forme et couleur des colonies

3. Type respiratoire Gélose profonde de type VL et VF (glucose) dans tube 8 x 180 mm Régénération par BM bouillant 30 min puis rabaisse la T° à 45°C Ensemencement avec pipette pasteur du bas vers le haut en décrivant spirale Refroidissement, Incubation Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Type énergétique et respiratoire IAA  hétérotrophes (énergie par dégradation de substrat carboné par déshydrogénation)

4. fermentation Métabolisme oxydatif Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Type respiratoire • Fermentation  formation acides ou alcools • Métabolisme oxydatif  pas ou très peu • Gaz : cloche de Durham ou couche de paraffine… • Fermentation  production de gaz qui forment des poches (dans gélose) ou dans cloche de Durham car libéré ou fond du tube • Métabolisme oxydatif  production de gaz mais pas dans la cloche car production en surface

5. Réductions des nitrites et nitrates 2 NO2- + 8 (H+, e) NO2- + H+ + 6 (H+, e) NO3- + 2 (H+, e) NO3- + 2 (H+, e) NO2- + H2O NO2- + H2O N2 + 4 H2O NH3 + 2 H2O A B Nitrate réductase Nitrite réductase Mise en évidence par réaction colorimétrique des nitrites : réactif de Griess-Ilosways Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Mise en évidence d’une respiration anaérobie Respiration anaérobie  utilisation de minéraux oxydés comme accepteur des H et e issus de l’oxydation des substrats Utilisation anaérobie des nitrates et nitrites : milieu VF ou VL additionnés de nitrates ou nitrites. +  culture en profondeur du tube mince ouvert, soit culture en tube sous paraffine avec dans les 2 cas une production de gaz

6. Après ajout de 3 gouttes d’acide sulfanilique puis 3 gouttes d’alpha naphtylamine Le milieu devient rouge : présence de nitrites. Donc la bactérie possède une nitrate réductase. Résultat NR+ Après ajout de la poudre de zinc coloration rouge : on a donc eu transformation des nitrates en nitrites par le zinc. La bactérie ne possédait pas cette enzyme. Résultat NR- Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Mise en évidence d’une respiration anaérobie : milieu + nitrate Après ajout de la poudre de zinc pas de coloration : les nitrates ont été transformés par la bactérie au delà des nitrites. La bactérie possède cette enzyme. Résultat NR+

7. Mise en évidence des enzymes respiratoires Oxydase Interviennent à la fin des étapes de déshydrogénation et des chaînes de cytochromes Mise en évidence par propriété de catalyser la réaction d’oxydation d’un substrat organique par l’oxygène de l’air. Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Mise en évidence du pouvoir réducteur Utilisation des accepteurs organiques comme le bleu de méthylène, chlorure de tétrazolium (TTC) ou teinture de tournesol. Réduction  changement de couleur Bleu de méthylène décoloré par les germes possédant une activité réductasique Réduction du TCC  virage au rouge brun Réduction du tournesol  décoloration Rem : B de M utilisation pour estimation de la charge microbienne des laits

8. Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Mise en évidence des enzymes respiratoires Oxydase N-diméthyl paraphénylène diamine (incolore sous forme réduite et rouge-violet sous forme oxydée) Oxydase +  souche possède une enzyme capable d’oxyder le substrat Culture jeune sur gélose puis pulvérisation du réactif à la surface. Colonies +  rouge en qqs secondes Papier filtre imbibé de réactif Inoculum dense Colonie isolée 10-15 sec Bactérie oxydase - (E.coli) Bactérie oxydase + (P.aeruginosa)

9. Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Mise en évidence des enzymes respiratoires Catalase Dégradation de H2O2 Contact entre culture et H2O2 dégagement gazeux par action de la catalase  bulles H2O2 → H2O + 1/2 O2

10. Méthode auxanographique Milieu solide ou semi-solide en boite de Pétri sans glucides Petites pincées de divers sucres réparties dans zones précises (ou utilisation de disques  visualisation de croissance ou virage d’un indicateur coloré Utilisation de galeries (API 50CH, API 20C…) Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme glucidique Milieux contenant du glucose ou autres

11. Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Méthode par culture classique Ajout à différents milieu de culture de sucre : Appréciation de la culture par rapport à un milieu sans sucre Virage d’un indicateur pH Utilisation de milieu complexe Surtout pour les Entérobactéries : étude du métabolisme, production de gaz et autres caractères

12. Réactif de Kovac. Milieu SIM S. aureus Non-motileNegative for H2S production Milieu SIM S. typhimurium  MotilePositive for H2S production Milieu SIM P. vulgaris  MotilePositive for H2S production + indole - indole Milieu SIM Contrôle

13. Milieu présente une forte coloration noire : hydrolyse de l’esculine : esculine + Le milieu ne présente pas de coloration noire : esculine - Esculinase : glucose et esculétine Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Utilisation hétérosides Hydrolyse esculine ou arbutine : Détecté par une réaction chimique Technique délicate et résultats douteux

14. ONPG - ONPG+ Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Caractérisation d’enzymes Recherche b galactosidase par l’ONPG : Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside

15. Utilisation de galeries : API ZYM Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Caractérisation d’enzymes Autres enzymes recherchées : b glucuronidase, phosphatase….Dans tous les cas substrat à base de naphtol

16. Plus d’amidon amylolytique Ensemencer à la surface du milieu. Incuber un à huit jours à la température désirée. Amidon Non amylolytique Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Dégradation des macromolécules glucidiques Caractère amylolytique ou pectinolytique Ajout solution iodée

17. Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Caractérisation de divers types fermentaires Bactéries dégradant le pyruvate par le voie des fermentations acides mixtes : -> acide formique, acétique, lactique, succinique, CO2, H2, éthanol. Le rouge de méthyl est jaune pour pH > 6.5 et rouge pour pH < 3.5 (bactéries RM+) Milieu de Clark et Lubs après fermentation du glucose. L ’hydroxy-3-butanone (acétoïne) produit par les fermentations butanediolique est révélé par la réaction de Voges-Proskauer. Milieu de Clark et Lubs en présence d ’O2, de KOH et de a-naphtol après 48h de culture => produit rouge (bactéries VP+)

18. Excrétion de polysaccharides Macromolécules : levanes, dextranes… Colonies gluantes sur certains milieux Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique

19. Dégradation de l’urée uréase Urée  Alcalinisation du milieu NH3 et CO3 (NH4)2 Milieu de Fergusson (urée-indole) de Stuart : rouge de phénol Virage au rouge si augmentation de pH Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme azoté et protéique Etude des sources d’azote utilisables Détermination des produits azotés utilisables comme source d’azote Milieu synthétique sans peptone puis ajout de divers source d’azote (cf méthodes auxanographiques)

20. Incubation Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme azoté et protéique Hydrolyse des protéines Hydrolyse de la caséine : lait gélosé (clarification), lait liquide (coagulation, jaunissement), lait glucosé, lait tournesolé

21. Test + Test - Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme azoté et protéique Hydrolyse des protéines Culture en culot : milieu à la gélatine préparé, puis répartit en culot. Piqûre centrale puis incubation de 48 heures à 2 semaines  liquéfaction ou non. Utilisation de disques de gélatine au charbon : disque dans un bouillon de culture

22. Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme azoté et protéique Métabolisme des AA Production ammoniac : culture sur milieu contenant un AA particulier (arginine). Ammoniac mis en évidence par réactif de Nessler : goutte de milieu sur lame + réactif  coloration orange si + Production H2S : mise en évidence par formation de sulfure de fer en milieu solide (protéines + sulfate de fer  noircissement au niveau de l’inoculation) Dégradation d’acides aminés particuliers : décarboxylases (amines), désaminases (acide + ammoniac)…: utilisés pour Entérobactéries et Pseudomonas

23. - + +/- Consommation glc Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme azoté et protéique Métabolisme des AA Test LDC « classique » : à partir d ’une culture sur Kligler-Hajna, extraction de la cadavérine au chloroforme, révélation (violet si positif) à la ninhydrine Test décarboxylases et ADH : Utilisation d ’un milieu contenant du glucose, un seul aa, un indicateur de pH (bromocrésol pourpre) -> acidification rapide par consommation du glucose, puis alcalinisation du milieu (NH3, diamines) si consommation de l ’aa

24. l'action de la lécithinase libère de la choline soluble et un diglycéride peu soluble qui précipite dans le milieu provoquant un hâlo autour de la culture Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etude du métabolisme des lipides Activité lipasique (estérasique) : milieu additionné d’huile d’olive + bleu Victoria (apparition d’un précipité bleu du aux sels d’acide gras), milieu au jaune d’œuf (lécithinasique)

25. 18-24h (37°C) Bactérie immobile (K.pneumoniae) Bactérie mobile (Proteus) Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etudes d’autres propriétés physiologiques Mobilité Ensemmencement par piqûre au fil droit → envahissement plus ou moins grand de la totalité du milieu à partir de la piqûre

26. Milieu bleu : pyocyanine Milieu jaune- vert : pyoverdine Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etudes d’autres propriétés physiologiques Formation de pigment Milieux spéciaux pour certains genres bactériens : Milieu au cétrimide , King A et B pour Pseudomonas Présence d’inducteur pour la pigmentogénèse

27. Halophilie Osmophilie Milieux avec des concentrations croissantes en glucose ou saccharose (max 60%) ou de NaCl (max 10%) - + Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude biochimique et physiologique Etudes d’autres propriétés physiologiques Besoin en vitamines ou en facteurs de croissance Culture sur milieux synthétiques contenant des vitamines ou facteurs de croissance Résistance aux antibiotiques ou aux inhibiteurs

28. Autres méthodes d’identification Étude du pouvoir pathogène Recherche d’enzymes participant au pouvoir pathogène Hémolysines, coagulases, ADNases, phosphatase Techniques d’étude et d’identification microbiennes Étude immunologique Études des relations entre substances étrangères à un organisme supérieur (antigènes) et les défenses spécifiques de cet organisme (anticorps) Précipitation ou agglutination en milieu liquide, Immunofluorescence, Immuno-enzymologie (ELISA)…

29. Hémolyse b : zone claire d’hémolyse totale de diamètre 3-4 mm  entourant les colonies. Hémolyse a : zone floue et granuleuse, verdâtre de 1 à 2 mm de diamètre 0,5 mL de plasma oxalaté + 0,5 mL  d’une culture de 18 h en bouillon coeur cervelle de la souche à étudier. - Coagulation du plasma => Coagulase + => Staphylococcusaureus. - Pas de coagulation du plasma => Coagulase -

30. Pouvoir pathogène expérimental Animaux (toxine botulique), anse intestinale isolée (entérotoxine), culture de tissus Techniques d’étude et d’identification microbiennes Autres méthodes d’identification Étude du pouvoir pathogène Recherche de toxines

31. Electrophorèse d’enzymes ou empreinte protéique Protéines extraites → PAGE ou PAGE-SDS → révélation Techniques d’étude et d’identification microbiennes Autres méthodes d’identification Analyse d’enzymes ou de produits du métabolisme Chemotaxinomie Empreinte chimique des bactéries par analyse du milieu de culture en phase gazeuse simple ou capillaire, ou par couplage CPG/MS Utilisée en brasserie pour la détection de contaminants qui altèrent les spectre des acides gras

32. Compositions des acides nucléiques Rapport AT/CG Hybridation de l’ADN Sonde génétique : déterminations d’homologie ADN/ADN > 80% : biotype d’une même espèce < 30% : genres différents Entre 30 et 80% : espèces appartenant au même genre Sondes génétiques, hybridation in situ Techniques d’étude et d’identification microbiennes Autres méthodes d’identification Techniques génétiques Détermination de la taille du génome Temps pour demi renaturation (t1/2) → corrélation entre t1/2 et taille du génome

33. Électrophorèse en champ pulsé Séparation des chromosomes en fonction de leur tailles Polymorphisme de restriction Techniques d’étude et d’identification microbiennes Autres méthodes d’identification Techniques génétiques Séquences des ARN ribosomaux ARN 5S et 16S : isolées des sous unités 50S et 30S des ribosomes bactériens Contiennent des régions conservées et des régions variables