INFORMACJA GENETYCZNA (jądrowa i mitochondrialna) Organizacja i jej wykorzystanie

BIOLOGIA KOMÓRKI(WYKŁAD 1, cz.2, BIOLOGIA, KIERUNEK LEKARSKI)klucz do platformy e-learning - biologia142 INFORMACJA GENETYCZNA (jądrowa i mitochondrialna) • Organizacja i jej wykorzystanie • Kwasy nukleinowe • Budowa chromatyny • Budowa genów prokariota i eukariota • Regulacja replikacji DNA u prokariota i eukariota • Regulacja transkrypcji - elementy regulatorowe cis i trans • Translacja i jej regulacja – modyfikacje potranslacyjne http://biolmolgen.slam.katowice.pl/ • Aleksander L. Sieroń

WYKŁAD 1; c.d.(BIOLOGIA I BIOLOGIA Z GENETYKĄ; KIERUNKI: LEKARSKI, FIZJOTERAPIA, PIELĘGNIARSTWO I POŁOŻNICTWO) INFORMACJA GENETYCZNA NOŚNIKI DNA JEDNONICIOWY DWUNICIOWY RNA GENY PROKARIOTYCZNE EUKARIOTYCZNE REPLIKACJA TRANSKRYPCJA TRANSLACJA • Aleksander L. Sieroń

Jądro komórkowe (Nucleus) KOMÓRKA ZWIERZĘCA Jąderko (Nucleolus) • Aleksander L. Sieroń

Chromatyna Skupiska ziarnistości interchromatynowych Wycinek obrazu jądra komórkowego w mikroskopie elektronowym transmisyjnym. Widoczne są wyraźne skupiska ziarnistości interchromatynowych (IGC). Michael J. et al. 1998, MBC, 9: 2491-2507

Chromatyna najbardziej zagęszczona Organizacja DNA w jądrze fibroblastów. Cyfrowo opracowane skrawki mikroskopowe przygotowane niezależnie do barwienia DNA i SC35, czynnika składania mRNA. Pokazane rozmieszczenie DNA (barwnik zielony) i SC35 (barwnik czerwony). Dwa pierwsze zdjęcia, to skrajne skrawki powierzchniowe. Ostatnie zdjęcie to powierzchnia jądra komórkowego najbliższa zakotwiczenia komórki. Duże strzałki – obszary pozbawione chromatyny. Małe strzałki - najbardziej zagęszczone obszary chromatyny. Brak chromatyny SC35 DNA 10mm Michael J. et al. 1998, MBC, 9: 2491-2507

DNA JEDNONICIOWY CUKIER DEZOKSYRYBOZA ZASADA AZOTOWA PIRYMIDYNA ZASADA AZOTOWA PURYNA RESZTA KWASU FOSFOROWEGO MAJĄ GO NIEKTÓRE WIRUSY TYPU DNA • Aleksander L. Sieroń

DNA DWUNICIOWY CUKIER DEZOKSYRYBOZA MAJĄ GO WSZYSTKIE EUKARIOTA, BAKTERIE I WIĘKSZOŚĆ WIRUSÓW TYPU DNA ZASADA AZOTOWA PIRYMIDYNA ZASADA AZOTOWA PURYNA RESZTA KWASU FOSFOROWEGO C G A T • Aleksander L. Sieroń

RNA JEDNONICIOWY CUKIER RYBOZA ZASADA AZOTOWA PIRYMIDYNA ZASADA AZOTOWA PURYNA RESZTA KWASU FOSFOROWEGO MAJĄ GO WIRUSY TYPU RNA (RETROWIRUSY) URACYL ZA TYMINĘ • Aleksander L. Sieroń

DNA może „kształtować siebie” na różne sposoby aby „osiągnąć własne cele w życiu”. Struktura krystaliczna połączeń między dwiema jego formami dostarcza informacji o tym jak DNA może osiągać te „akrobatyczne” figury. wypchnięta T wypchnięta A Nowy skręt. Struktura połączenia dwóch form B–Z opracowana przez Ha et al. (Ha, S. C., Lowenhaupt, K., Rich, A., Kim, Y. G. & Kim, K. K. Nature 437, 1183–1186 (2005). Obszar lewoskrętny Z-DNA łączy się z prawoskrętną strukturą B-DNA poprzez złącze, w którym jedna para zasad jest wykręcona na zewnątrz lub wystaje z heliksu DNA. (Ryc. zmodyfikowana z Sinden, NATURE, 437, 2005)

Upakowanie DNA w nukleosomie (około 200 par zasad/nukleosom) histony 2x [H2A, H2B, H3 i H4] (niebieskie i zielone) H1 (żółty) DNA 146 pz DNA między nukleosomami około 60 pz

Schemat upakowania DNA w nukleosomie

Nić DNA Włókno Nukleosomalne Solenoid Supersolenoid Chromatyda Chromosom

GEN EUKARIOTYCZNY (jest podzielony) Elementy regulatorowe typu cis Promotor (kasety bogate w AT) E1 I1 E2 I2 En Ex Ix UAA STOP ATG START UAG UGA Elementy regulatorowe typu trans SEKWENCJE KODUJĄCE [EXONY] SEKWENCJE NIEKODUJĄCE [INTRONY] GEN PROKARIOTYCZNY (jest ciągły) GEN 1 E1 E1 Promotor E1 ATG STOP GEN 2 GEN 4 E1 GEN 3 • Aleksander L. Sieroń

GEN • jest to odcinek DNA, • zawierający sekwencje: • regulatorowe • promotora • „strukturalne” • Aleksander L. Sieroń

KAŻDY GEN WYSTĘPUJE W CO NAJMNIEJ DWÓCH FORMACH, ZWANYCH ALLELAMI • Aleksander L. Sieroń

nić wyjściowa nić nowo-syntetyzowana 1. Model semikonserwatywny 2. Model konserwatywny Replikacja DNA w/g Messelson & Stahl 1957 • Aleksander L. Sieroń

PO JEDNYM POKOLENIU 2. konserwatywnie 1. semikonserwatywnie PO WIELU POKOLENIACH 1. semikonserwatywnie 2. konserwatywnie • Aleksander L. Sieroń

1) INICJACJA - Widełki replikacyjne Helikaza - rozsuwa nici podwójnej helisy, po usunięciu super-splątanego odcinka przez topizomerazę. Helikaza wymaga do swego działania energii, w postaci ATP, aby rozdzielić obie nici helisy, ponieważ oddziałują one ze sobą mocno za pośrednictwem bardzo licznych wiązań wodorowych. Topoizomeraza - odpowiada za rozpoczęcie rozplątywania DNA. Napięcie w strukturze heliksu w postaci splątanej (coiled) i supersplątanej (supercoiled structure) może spowodować peknięcie przez nadmierne „naciągnięcie” pojedynczej nici DNA, tak jak przy nadmiernym skręcaniu wokół siebie dwóch sprężyn trzymanych za końce. Przecięcie tylko jednej ze sprężyn zmniejszy więc napięcie wywołane skręcaniem i obie sprężyny rozkręcą się przy udziale Nić oryginalna Nowa nić Starter RNA Strzałki wskazują kierunek replikacji DNA Nić opóźniona Nić wiodąca Fragment Okazaki Topoizomeraza Helikaza Zespół replikacyjny ORI MIEJSCA INICJACJI REPLIKACJI • Aleksander L. Sieroń

Aleksander L. Sieroń (2005/2006) Elongacja Polimeraza DNA - postępuje wzdłuż pojedynczej nici DNA rekrutując wolne dNTP (dezoksy-nucleotydo-trójfosforan) do tworzenia wiązań wodorowych z właściwymi dla nich komplemen-tarnymi dNTP w pojedynczej nici (A z T i G z C), oraz tworzenia kowalencyjnych wiązań dwuestrowych z poprzedzającym nukleotydem nowosyntetyzowanej nici. Energia zmagazynowa-na w trójfosforanach jest używana do wiązania każdego nowego nukleotydu w rosnącej nici. Istnieją różne popstacie polimerazy DNA, jednak to polimeraza DNA III jest tą, która odpowiada za postępującą syntezę nowych nici DNA. Polimeraza DNA NIE MOŻE rozpocząć syntezy de novo na gołej nici. Wymaga ona starterów (primerów) z grupą 3'OH do której może być przyłączony dNTP. Polimeraza DNA jest zasadniczo kompleksem kilkunastu różnych podjednostek białkowych i dlatego jest często nazywana holoenzymem. Ten holoenzym posiada również aktywność kontrolną zapewniającą wstawianie odpowiedniej zasady, a także właściwości nukleazowe (wycinanie nukleotydów), które pozwalają na usuwanie błędów powstałych podczas syntezy. Ligaza - katalizuje tworzenie wiązań fosfo-dwuestrowych między sąsiadującymi końcami 3'OH i 5’fosforanu. Usuwa ona przerwę powstałą po usunięciu primera RNA. Polimeraza DNA katalizuje wiązanie na końcu 5' tego startera, ale ligaza jest potrzebna do utworzenia wiązania na jego końcu 3'. Białka wiążące jednoniciowy DNA - są ważne dla podtrzymania stabilności widełek replikacyjnych. Jednoniciowy DNA jest niestabilny, dlatego białka te wiążą się do niego przez cały czas gdy pozostaje on jako pojedyncze nici, chroniąc go przed degradacją. Nić oryginalna Nowa nić Starter RNA Strzałki wskazują kierunek replikacji DNA Nić opóźniona Nić wiodąca Fragment Okazaki Primaza - jest częścią kompleksu białkowego zwanego primeosomem. Enzym ten syntezuje krótki starter (primer) RNA do jednoniciowego DNA, który działa jako substytut końca 3'OH dla polimerazy DNA rozpoczynającej syntezę nowej nici. Starter RNA jest później usuwany przez RNazę H, a powstała przerwa jest wypełniana przez polimerazę DNA I. Polimeraza DNA Zespół replikacyjny Primaza ORI Ligaza (po RNAzie H) Białka wiążące jednoniciowy DNA

Komórki HeLa zielone od 5-fluorourydyny wbudowanej do RNA. http://www.cellnucleus.org/

Drobiny Znakowanie immunofluorescencyjne. Po usunięciu tła w obrazie z lewej strony. Fibroblasty znakowane przeciwciałami anty-SC35 do czynnika składania mRNA - 35. Michael J. et al. 1998, MBC, 9: 2491-2507

Dużej rozdzielczości mapa fosforowa RNA. Numerowane są pojedyncze ziarnistości występujące jako białe plamy na czarnym tle. Większość ziarnistości cechuje się obecnością RNA w postaci pofałdowanych ziarnistych struktur włókienkowych. Michael J. et al. 1998, MBC, 9: 2491-2507

Zależność między chromatyną acetylowaną i aktywnie transkrybowaną. Prawidłowe fibroblasty skóry człowieka inkubowano przez 1 h w obecności 5 mMbromo-urydyny, utrwalano i barwiono DPAI (lewy górny panel oraz niebieskiezabarwienie w pozostałych panelach), przeciwciałami przeciwko acetylowanemu histonowi H3 (zabarwienie czerwonew prawych panelach) oraz bromo-urydynie (zabarwienie zielonew dolnych panelach). Zabarwienie żółte wskazuje występowanie domen podobnych do IGC pozbawionych chromatyny. Czerwone kropki wskazują miejsca domen jąderkowych. Skala, 10 µm Michael J. et al. 1998, MBC, 9: 2491-2507

ZAPOCZĄTKOWANIE TRANSKRYPCJI INICJACJA gen X początek transkrypcji pary zasad Nić nonsensowa - niekodująca AACTGT ATATTA Nić sensowa - kodująca • Aleksander L. Sieroń

JĄDRO „CYTOZOL” pakowanie, metylacja, rearanżacje, amplifikacje, heterochromatyna, inaktywacja-X, reorganizacja DNA DNA promotory, wzmacniacze, czynniki transkrypcji, białka wiążące, represory TRANSKRYPT RNA kapowanie, ogon poli-A, składanie, zmienne składanie FUNKCJONALNY RNA

Kompleksy modyfikacji chromatyny Kompleksy przebudowy chromatyny REGULACJA EKSPRESJI GENU DNA jest upakowany w nukleosomach i wyższorzędowych strukturach chromatyny Aktywatory wiążą elementy regulatorowe Aktywatory rekrutują kompleksy przebudowujące i modyfikujące chromatynę http://web.wi.mit.edu/young/pub/activators_initiation.html

Holoenzym Polimerazy IIRNA TFIID REGULACJA EKSPRESJI GENU Aktywatory rekrutują składniki aparatu transkrypcyjnego Aktywatory mogą stymulować aktywność powstałego aparatu transkrypcyjnego http://web.wi.mit.edu/young/pub/activators_initiation.html

Promotor E1 I1 E2 I2 En Ex Ix TRANSKRYPCJA U EUKARIOTA heterogenny jdrowy RNA hnRNA E1 I1 E2 I2 En Ex Ix STOP ATG SEKWENCJE NIEKODUJĄCE [INTRONY] SEKWENCJE KODUJĄCE [EXONY] (wycinane przez białko CPSF73 w kompleksie z innymi białkami) informacyjny RNA mRNA E1 E2 Ex En Modyfikacja końca 5’ Dobudowanie czapeczki „kapowanie” Modyfikacja końca 3’ Dobudowanie ogona poliA „poliadenylacja” PoliA C • Aleksander L. Sieroń

pakowanie, metylacja, rearanżacje, amplifikacje, heterochromatyna, inaktywacja-X, reorganizacja DNA DNA promotory, wzmacniacze, czynniki transkrypcji, białka wiążące, represory TRANSKRYPT RNA JĄDRO kapowanie, ogon poli-A, składanie, zmienne składanie FUNKCJONALNY RNA „CYTOZOL” PRE-TRANSLACJA maskowanie, degradacja, dostarczanie TRANSLACJA wiązanie rybosomów, regulacja produktu końcowego BIAŁKO AKTYWNE BIAŁKO odcinanie, formowanie, modyfikacje grup R, fosforylacja NIEAKTYWNE BIAŁKO hamowanie, degradacja

Rodzaje RNA syntetyzowane • przez komórkę • mRNA - informacyjny RNA (ang. messenger RNA) • jest kopią genu. Powstaje jako fotokopia genu ponieważ sekwencja tworzących go zasad jest komplementarna do jednej nici DNA i identyczna z drugą nicią DNA. mRNA jest jak posłaniec do przenoszenia informacji zawartej w DNA znajdującym się w jądrze komórkowym do cytoplazmy, w której rybosomy używają jej do syntezy białek. • tRNA - transportujący RNA (ang. transfer RNA) • jest krótkim RNA o specyficznej budowie drugo- i trzeciorzędowej pozwalającej na wiązanie do jednego końca aminokwasu, a drugim końcem do mRNA. Działa więc jak adapter dostarczający składniki budulcowe białek do właściwego miejsca kodowanego przez mRNA. • rRNA - rybosomalny RNA (ang. ribosomal RNA) • jest podstawowym składnikiem budulcowym strukturalnym i funkcjonalymrybosomu. Ma sekwencję komplementarną do właściwych obszarów mRNA i dlatego umożliwia wiązanie mRNA do rybosomu w miejscu produkcji białka. • snRNA - krótki jądrowy RNA (ang. smallnuclear RNA) • bierze udział w obróbce różnych RNA podczas ich przechodzenia z jądra do cytoplazmy. Uczestniczy w regulacji ekspresji genów w jąderku. • siRNA - krótki interferujący RNA (ang. smallinterferring RNA) bierze udział w regulacji ekspresji genu na poziomie translacji poprzez degradację mRNA (Zob. dalej). • Aleksander L. Sieroń

cienkie linie przedstawiają komplementarne pary zasad tRNA • Aleksander L. Sieroń

Akceptor Pętla TψC Pętla D Pętla zmienna Pętla antykodonu Schemat budowy tRNA • Aleksander L. Sieroń

Rosnący polipeptyd Met Przychodzący tRNA Podjednostka większa Podjednostka mniejsza Sekwencje zgodności Kozaka przed kodonem AUG AUG mRNA Centrum dekodujące Podstawową funkcją rybosomu w fazie elongacyjnej syntezy białka jest ustawienie aminokwasów poprzez transportujące je tRNA dokładnie na przeciw odpowiadających im kodonów w mRNA. Aminokwwas połączony w miejscu CCA na końcu tRNA jest przenoszony w pobliże poprzednio przyłączonego do łańcucha aminokwasu. • Aleksander L. Sieroń

DWIE PODJEDNOSTKI RYBOSOMU Z PRZYŁĄCZONOMI 3 CZĄSTECZKAMI tRNA • PODJEDNOSTKA MNIEJSZA • PODJEDNOSTKA WIEKSZA Pień L7/L12 Wyniosłość centralna Głowa Miejsce P Miejsce P Miejsce A Miejsce E Miejsce E Pień L1 Miejsce A Ramię Podstawa pnia Platforma Ostroga • Aleksander L. Sieroń

RYBOSOMY RÓŻNYCH GATUNKÓW (mała podjednostka po stronie lewej) E. Coli 70S T. thermophilus Drożdże 80S Mitochondria ssaków PM PD PM PD PM PD PM PD PM – podjednostka mniejsza PD – podjednostka duża • Aleksander L. Sieroń

Etap 1: Transkrypcja Etap 2: Translacja Podwójna helisa DNA Transportujący RNA Aminokwasy Polimeraza RNA Rybosomalny RNA Antykodon Białka Nukleotydy RNA Łańcuch polipeptydowy Otoczka jądrowa Infromacyjny RNA opuszcza jądro komórkowe Transportujący RNA z aminokwasami Rybosom Informacyjny RNA Kodon • Aleksander L. Sieroń

KOD GENETYCZNY POZYCJA DRUGA U C A G U C A G fenylo- alaniana tyrozyna cysteina U seryna STOP STOP leucyna STOP tryptofan U C A G histydyna C leucyna prolina arginina glutamina POZYCJA PIERWSZA POZYCJA TRZECIA U C A G seryna asparagina izoleucyna A treonina lizyna arginina * metionina U C A G kwas asparaginowy G walina alanina glicyna kwas glutaminowy * i start GGU – glicyna CGU - arginina • Aleksander L. Sieroń

transkrypcja translacja białka Podstawowy dogmat biologii Mikro i antysens RNA siRNA Jednokierunkowa liniowość przepływu informacji genetycznej odwrotna transkrypcja Modyfikacje po-transkrypcyjne i po-translacyjne z wymieszaniem sekwencji (brak odpowiednich sekwencji kodujących w genach) • Aleksander L. Sieroń

K O N I E C CZĘŚCI 2 DZIĘKUJĘ

INFORMACJA GENETYCZNA (jądrowa i mitochondrialna) Organizacja i jej wykorzystanie