Tema 10. VALORACIÓN DE RESULTADOS.

1. Métodos alternativos a la Experimentación Animal Tema 10. VALORACIÓN DE RESULTADOS.

2. Relación dosis-respuesta Base para la evaluación del peligro y el riesgo

3. FORMAS DE DETERMINAR LA TOXICIDAD • Efectos bioquímicos • Modificaciones fisiológicas • Alteraciones reproductivas • Muerte: DL50 • NOEC • PRINCIPIOS ESTADÍSTICOS • Diseño experimental • Muestreo • Modelización • Recolección de datos • Las pruebas y las metodologías • Interpretación de los resultados

4. CUALITATIVAS • Discretas (números enteros) • CUANTITATIVAS • Continuas (números reales) Cuantitativamente Regresión Regresión Análisis de relaciones • Dos o más variables • Análisis de regresión • Selección de la ecuación matemática (el modelo) • Depende del tipo de variables Las variables

5. MODELOS MATEMÁTICOS EN EL ANÁLISIS DE RELACIONES MECANÍSTICO Describir un proceso basándose en postulados acerca de la mecánica de dicho proceso EMPÍRICO O DESCRIPTIVO Describir cuantitativamente los patrones de las observaciones sin basarse en los procesos subyacentes o mecánica del proceso DETERMINÍSTICO O NO ESTOCÁSTICO Dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo es siempre el mismo valor PROBABILÍSTICO O ESTOCÁSTICO Dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo es un valor variable

6. MÉTODOS ESTADÍSTICOS • Necesarios para la validez y precisión de las pruebas • Sobre diseño, planificación, ejecución y análisis de resultados • Seleccionar un método estadístico sencillo ajustado a las condiciones experimentales que permita obtener resultados válidos DISEÑOS DE EXPERIMENTOS DE TOXICIDAD • Nº razonable de repeticiones • Aleatorización de las dosis • Existencia de un control necesario para estimar el error experimental

7. DISEÑO Y EJECUCIÓN DE ENSAYOS DE TOXICIDAD ELEMENTOS ESTADÍSTICOS PARA EL DISEÑO - UNIDAD EXPERIMENTAL - RESPUESTA (punto final) Observación, medición, identificación - CONDICIONES PARA LA EVALUACIÓN Tamaño de la población, ensayo de supervivencia en paralelo - GRUPOS DE TRATAMIENTO Dosis-respuesta, controles, varias muestras individuales - FUENTES DE VARIABILIDAD (dentro y entre ensayos) - FUENTES DE SESGOS - MÉTODOS DE EVALUACIÓN ESTADÍSTICA

8. ENTRE ENSAYOS ¿reproducibilidad? ELEMENTOS ESTADÍSTICOS PARA EL DISEÑO - FUENTES DE VARIABILIDAD (dentro y entre ensayos) DENTRO DE LOS ENSAYOS Errores en diluciones Imprecisiones en el pesado Errores al medir volúmenes Errores en el conteo Variación biológica (genética, fisiológica) Etc Las propiedades físicas y químicas de los agentes Almacenamiento y preparación Cambios en las condiciones de cultivo de los organismos Cambios históricos en el protocolo Cambios en el personal del laboratorio Cambios genéticos en el material biológico

9. Reproducibilidad o replicabilidad • Propiedades físicas y químicas de los compuestos conocidas y controladas • Preparación y almacenamiento de los compuestos, solventes y diluciones controlados • Manejo y uso de los organismos prueba (animales, células) • Número de repeticiones del ensayo • Número de tratamiento/grupos de dosis • Intervalos de las dosis • Selección de controles • ALEATORIZACIÓN

10. DISEÑOS MÁS COMUNES EN LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD • Establecimiento de la relación dosis-respuesta • Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados o expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0) TIPOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE RESULTADOS Suposiciones y/o estimaciones acerca de los parámetros de las distribuciones probabilísticas de la variable • Paramétricos • No paramétricos

11. ¿………? - De tipo mortalidad Análisis de regresión y análisis Probit (paramétrico) concentración Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico) Método de Spearman-Kärber (no paramétrico) Método gráfico • De tipo inhibición del crecimiento (variable cuantitativa continua) • Establecimiento de la relación dosis-respuesta Obtener las estimaciones de los parámetros del modelo seleccionado para relacionar las variables. Y utilizar el modelo con las estimaciones de los parámetros encontrados para determinar los valores de la variable concentración de tóxico que causan un grado de efecto sobre los organismos expuestos.

12. - De tipo mortalidad (Estimación de CL50, CE50 , CI50) Probit Dos o más mortalidades No Sí Litchfield-Wilcoxon No No ¿Una o más mortalidades parciales? ¿Adecuación del modelo? ¿Significación estadística? Método gráfico CL50 Spearman-Kärber Sí Sí Método gráfico No ¿Mortalidad nula en la CE más baja y letalidad total en la más alta? Método Probit Sí Método de Sperman-Karber Método de Sperman-Karber ajustado CL50 e intervalo de confianza al 95%

13. tablas de Probit p (porcentaje de efecto) unidades probit - De tipo mortalidad Análisis de regresión y análisis Probit (paramétrico) • Concentración de la sustancia o dosis (d). • Número de individuos (n). • Número de organismos muertos o afectados (r). • Porcentaje de efecto (p). p = (r/n) x100 Transformación a escala logarítmica X = log10(d)

14. DETERMINACIÓN DE CL50, CE50, CI50 Mediante el uso de la recta trazada se obtiene en el eje logarítmico la concentración correspondiente al 50% del efecto observado sobre el eje probabilístico Log X - De tipo mortalidad Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico) Construcción de un gráfica a partir de los datos de las pruebas de toxicidad aguda

15. 2,77 E = N’ CL84 /CL50 + CL50 /CL16 S = 2 - De tipo mortalidad Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico) • - Obtener las concentraciones de 16, 50 y 84% • Calcular la pendiente de la recta (S): • Calcular el número de individuos (N) en los que se observó porcentaje de efecto entre 16 y 84% • Calcular el exponente E y con él calcular el factor fCL50. • CALCULAR EL INTERVALO DE CONFIANZA CÁLCULO DEL INTERVALO DE CONFIANZA f CL50 = SE (CL50) (fCL50) = límite superior al 95% de confianza (CL50/Fcl50) = límite inferior

16. Xk = dosis mínima a partir de la cual todas las reacciones son del 100%. d = distancia entre cada dos dosis. S1 = suma de las fracciones de individuos que presentaron reacción. S2 = suma de la fracción acumulada de los individuos que presentaron reacción. - De tipo mortalidad Método de Spearman-Kärber (no paramétrico) Proporciona una buena estimación de la media y la desviación estándar CL50 = m =Xk – d (S1 – ½) Sn = 2S2 – S1 –S12 – 1/12

17. - De tipo inhibición de crecimiento VARIABLE CUANTITATIVA CONTINUA • Estimación de la relación D-R con métodos de regresión • Transformación de la concentración a logaritmos para obtener una distribución normal • - Transformación de variable respuesta en función de la distribución

18. - Supuestos de ANOVA: • Varianzas homogéneas (Ej. Prueba de Barlett o de Levenne) • Independencia de errores • Distribución normal de los residuos (Prueba de Shapiro-Wilk) - Nº de replicados por tratamiento sea > 3 (OBLIGATORIO) - Todos los tratamientos tengan el mismo número de replicados Prueba de t con ajuste de Bonferroni 2- Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0) • Para la determinación del NOEC y del LOEC • Implica pruebas de hipótesis • ANOVA seguido de la prueba a posteriori de Dunnet. REQUISITOS:

19. Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0) Si no se verifican los supuestos de ANOVA: • Transformar la variable dependiente (respuesta) hasta obtener una que verifique dichos supuestos • Aplicar métodos no paramétricos Kruskal-Wallis Mann-Whitney Wilcoxon con ajuste de Bonferroni

20. Referencias • Díaz Baez, M.C., Bulus Rossini, G.D., Pica Granados, Y. 2004. Métodos Estadísticos para el Análisis de Resultados de Toxicidad. En ENSAYOS TOXICOLÓGICOS Y MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE CALIDAD DE AGUAS: Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. http://web.idrc.ca