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miRNA 与肿瘤

miRNA 与肿瘤. 中南大学肿瘤研究所 主讲：周 鸣 2011 年 10 月. 一、概述. 引 言. RNA 一度被认为仅仅是 DNA 和蛋白质之间的“过渡”，但 RNA 扮演的角色远比我们早前想象的更为重要。 在生物细胞内， RNA 含量丰富，除了 mRNA 、 tRNA 和 rRNA 外，还存在其它的非编码小 RNA ，构成了细胞内 高度复杂的 RNA 调控网络。 小 RNA 主要包括三种类型： 短链干扰 RNA (short interfering RNAs ， siRNA)

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miRNA 与肿瘤

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  1. miRNA与肿瘤 中南大学肿瘤研究所 主讲：周 鸣 2011年10月

  2. 一、概述 引 言 • RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但 RNA扮演的角色远比我们早前想象的更为重要。 • 在生物细胞内，RNA含量丰富，除了mRNA、tRNA和 rRNA外，还存在其它的非编码小RNA，构成了细胞内 高度复杂的RNA调控网络。 • 小RNA主要包括三种类型： 短链干扰RNA (short interfering RNAs，siRNA) 微小RNA (microRNA, miRNA) PIWI蛋白-作用RNA（piRNA）

  3. miRNA研究历程 • 1993年Lee等在秀丽新小杆线虫内首次发现miRNA编码基 因lin-4 ; 靶基因lin-14。 • 2000年由Reinhart等在线虫中发现第二种具有转录后调节 作用的miRNA编码基因Let-7 ；通过转录后调节lin-47和 lin-51的表达而控制线虫向成虫的转变。

  4. 3 microRNA • 3

  5. 3 • 3

  6. 3 • 3

  7. 2010: 3758 2009: 2545 2008: 1759 2007: 1073 2006: 704 2005: 418 2004: 221 2003: 110 2002: 37 2001: 5 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Pubmed 收录论文篇数

  8. miRNA命名规则 (1) microRNA(miRNA)简写成miR，再根据其被克隆的先后顺序 加上阿拉伯数字，如miR-21；(2) 高度同源的m i R N A 在数字后加上英文小写字母( a 、b 、 c)，如miR-199a和miR-199b；(3) 由不同染色体上的DNA 序列转录加工而成的具有相同成熟 体序列的miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以区分, 如miR- 199a-1和miR-199a-2；

  9. miRNA-miRNA duplex (4) 如果一个前体的2个臂分别加工产生miRNA， 则根据克隆实验，在表达水平较低的miRNA 后面加“* ”，如miR-199a和miR-199a*，或进 行如下命名，miR-142-5p和miR-142-3p；(5) 将物种缩写置于miRNA之前，如hsa-miR-195； mmu-miR-195(6) 确定命名规则之前发现的miRNA，如let-7，则 保留原来名字。

  10. 二、microRNA生物合成和生物学特性 （一）miRNA是一类蛋白非编码基因 • 成熟miRNA是由18～24个核苷酸组成的非编码单链RNA，是 一类在动植物中新发现的基因表达调控因子。 • 大多数miRNA是由基因编码而来，即存在自身的编码序列，又 有一套独立的基因调控元件进行转录。少数miRNA位于蛋白编 码基因的内含子中，与其共转录，然后再被剪切出来。 • miRNA在生物体内的多样化调控途径中扮演着重要角色，包 括控制发育进程、细胞分化、凋亡、分裂以及器官的发育。 基因是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位。

  11. （二）miRNA的生物合成 1. 成熟miRNA的合成过程 miRNA和蛋白质编码基因一样, 由gDNA转录而来。从gDNA到成熟miRNA经历一个十分复杂的转录、剪切、转运和成熟过程，包括： 初级转录产物的转录 (primary miRNA, pri-miRNA) microRNA前体的合成 (precusor miRNA, pre-miRNA) microRNA 前体的转运 microRNA 的成熟 miRNA对靶基因的转录后调控

  12. 2. miRNA的合成的影响因素 (1) 基因组稳定性和表观修饰 miRNA基因组存在杂合性缺失、基因扩增、突变、脆性位点等 基因组不稳定性特征和DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观修饰特征。 (2) 反式作用因子的表达和活性水平 miRNA的转录调控类似于经典蛋白编码基因，转录因子的表达水平、 修饰状态和活性水平均可能影响pri-miRNA的合成。 (3) Drosha和Dicer的表达和活性 Drosha酶介导从pri-miRNA到pre-miRNA的剪切过程；Dicer是介导 pre-miRNA到成熟miRNA的剪切过程。其结构、表达和活性均可能影响 miRNA成熟体的合成。 (4) miRNA合成和成熟过程中的转运调节 pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核/质转运蛋白Exportin 5的作用下， 从核内运输到胞质中，经Dicer进一步剪切成成熟的miRNA。

  13. (三) microRNA的生物学特性及功能 1. microRNA序列的结构特点 (1) miRNA的前体通常形成分子内茎环结构，含有大 量的U/G碱基对。成熟miRNA的5’端有一磷酸基团，3’端为羟基，这一特点使它与大多数寡核苷酸及功能RNA的降解片段区别开来。(插曲miR-923) （2）miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中, 绝大部分落于基因间隔区(inter-genic region, IGR)，也有少数包含在 已知基因的内含子中。 （3）大多数miRNA只从其前体双链的一侧加工而来，而成熟的siRNA 则是双链结构，既有正义链也有反义链。

  14. 2. microRNA参与基因转录后调控 根据miRNA与靶基因互补性的不同，miRNA存在两种不同的机制负性调控靶基因的表达： （1）当miRNA和靶基因mRNA的3’-UTR几乎完全配对时，miRNA诱导RNA介导的干扰途径，导致靶基因mRNA 转录本在miRNA 关联的多蛋白RNA介导的沉默复合体（miRISC）中被核酸酶剪切而降解。 （2）大多数miRNA与靶基因不完全互补，不足以产生序列特异性断裂。miRNAs与Ago 蛋白结合形成复合体后，靶向 mRNA 进入胞质处理小体(P-bodies)，通过三种方式抑制蛋白质合成： ① 诱导 mRNA 脱腺苷酸和脱帽，启动 mRNA 降解； ② 通过Ago蛋白和翻译起始因子竞争与mRNA m7G 帽子的结合， 阻碍功能性核糖体的装配，造成翻译起始抑制； ③ 通过募集与多肽链降解相关的细胞因子 (肽酶、翻译后修饰 酶)，使核糖体脱离肽链或新合成的肽链迅速降解。

  15. （三）microRNA的生理功能 在细胞增殖、分化、代谢、凋亡与发育过程中发挥重要的调节作用。 例如，1. 由lin-4和let-7编码的miRNA在线虫中控制了细胞分化和 增殖的时序； 2. miR-430参与了斑马鱼的大脑发育； 3. miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞； 4. miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌； 5. miR-143在脂肪细胞分化起作用； 此外，还有病毒基因组编码的miRNA, 如EBV编码23个miRNA 。其功能： 顺式调节病毒自身基因表达或反式调节宿主细胞基因表达，在病毒本身复制以及宿主细胞增殖、凋亡和恶性转化过程中发挥重要生物学功能。

  16. 三、恶性肿瘤的microRNA结构与表达异常 （一）恶性肿瘤相关性microRNA • 如果组织中某种或某些miRNA的表达失常，细胞内许多起重要作用的 瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表达失常，从而导致肿瘤的发 生。 • 有些miRNA具有类似抑癌基因功能，通过转录后负性调控致瘤性靶 基因的表达而发挥生物学功能；有些miRNA具有类似癌基因的作 用，通过下调抑瘤性靶基因的表达而发挥功能。

  17. （一）致瘤性microRNA （onco-miRNA） 在microRNA (miRNA)家族中，有些miRNA具有类似癌基因功能，与肿瘤发生呈正相关，这部分miRNA称为致瘤性miRNA（onco-miRNA），其过表达或持续活化将直接导致肿瘤的发生发展。 • miR-21 • （1）miR-21在乳腺癌、肝癌、脑瘤等多种恶性肿瘤中表达显著上 • 调，并与乳腺癌等肿瘤的恶性分级呈正相关； • （2）miR-21 可能通过抑制其靶基因 TPM1(tropomyosin 1)的表达而促进胶质瘤细胞的增殖。 • （3）miR-21通过负调控抑癌基因PTEN的表达，促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力 。 • （4）通过抑制PCD4 (programmed cell death 4) mRNA的翻译效率，抑制MCF-7的增殖。

  18. 2. miR-10b （1）miR-10b在侵袭性乳腺癌细胞系SUM315和MDA-231以及50%侵袭性乳腺癌活检组织（9/18）中表达上调。 （2）在非侵袭性的乳腺癌细胞系（HMEC和SUM149）中，miR-10b的过表达能促进细胞的迁移和侵袭能力，促进小鼠移植瘤肿瘤细胞的增殖和血管生成，并最终导致80%的实验组小鼠（8/10）发生多处肿瘤肺部转移 。 （3）HOXD10是 miR-10b的一个直接靶基因 ，miR-10b通过“miR-10b→HOXD10→RHOC→表型”途径发挥生物学效应。 RHOC为侵袭转移前体。

  19. （二）抑瘤性microRNA (suppressor miRNA) 在miRNA 家族中，有些miRNA具有类似抑癌基因功能，与肿瘤发生呈负相关，称为抑癌性miRNA（suppressor miRNA）。抑癌性miRNA的表达下降或者缺失，将直接导致肿瘤的形成。 1. let-7 家族 (1) Let-7是2000年由Reinhart等在线虫中发现的一种具有转录后调 节作用的miRNA，通过转录后调节lin-47和lin-51的表达而控制 线虫向成虫的转变。 (2) Ras 是Let-7的直接靶基因，受到let-7家族的负性调控。Ras是 一个膜相关的GTPase信号蛋白，具有调节细胞生长、分化 的功能，是一个重要的瘤基因。 (3) 在肺癌、乳腺癌、子宫癌等恶性肿瘤中，let-7家族与这些肿 瘤有关的脆性位点密切相关，在肺癌中其表达下调，是一个 与肺癌预后负相关的抑癌基因。

  20. 2．miR-15/16 • miR-15a和miR-16-1在白血病和淋巴瘤等恶性肿瘤中高表 • 达，具有负性调控抗凋亡基因bcl-2表达的功能。因此这两 • 个miRNAs的缺失或下调，导致bcl-2表达的升高，促进了白 • 血病和淋巴瘤的发生。 • 2个CLL病人在miR-16-1前体的下游7个碱基中有一个C突变 • 为T，这种突变导致miR-16-1的表达水平下降，进一步证明 • 了miR-16-1具有肿瘤抑制基因的作用。 • miR-16-1表达水平的下降多发现在各种白血病中。 • 超过65％（114）慢性淋巴细胞白血病人在13q14小于30kb的 • 区域存在miR15/16-1基因的杂合和纯合型缺失，在其它肿瘤（如淋巴瘤、骨髓瘤和前列腺癌）中也检测到该区域的LOH。

  21. (二) 恶性肿瘤microRNA的表达异常 (1) miRNA组 人类microRNA (miRNA)预测有1000个以上，这些miRNA共同构成了人类miRNA组。 在正常组织中，绝大部分miRNA高表达, 通过转录后负性调控靶基因的表达或降低mRNA的稳定性，在维持正常细胞的生长、分裂、分化、凋亡和器官发育等生命活动过程中发挥重要功能。 (2) 恶性肿瘤差异miRNA表达谱 采用高通量的miRNA芯片或qPCR技术检测肿瘤组织和相应正常组织中差异miRNA表达谱。 Muakami等对来自24个肝细胞癌(HCC)组织和22个临近正常组织(NT)的miRNAs表达谱进行分析，发现miR-18、miR-224在癌组织表达明显上调；miR-199a*、miR-195、miR-199a、miR-200a、miR-125a在癌组织中表达降低。

  22. (三)恶性肿瘤microRNA的结构异常 在恶性肿瘤基因组中常发生microRNA (miRNA)的表达异常或功能改变，其中有些miRNA的表达异常或缺失常伴随miRNA基因所在区域的结构异常或分子遗传学改变。 (1) miRNA突变 ① miRNA前体上的突变或多态性影响miRNA的加工成熟或miRNA本身的功能。 如miR-15a/16-1前体上游7bp的C/T多态位点，位于miR-125a成熟体的G/T多态位点，影响了miRNA的生物学功能。 ② 有些miRNA的突变位于miRNA编码基因的启动子或调控区，可能直接导致其启动子活性的异常或影响反式作用因子与启动子区结合而影响启动子的活性，从而导致miRNA表达水平的异常

  23. (2) 杂合性缺失 ① 杂合性缺失是肿瘤抑瘤基因或miRNA表达缺失或失活的一种重 要机制。 通过对已知186个miRNA分子的染色体定位与数据库中的相关位 点进行比对分析，发现65个miRNA定位于LOH区域。 miR-15和miR-16定位于染色体13q14。超过65％（114）慢性淋巴细胞白血病人在13q14小于30kb的 区域存在miR15/16-1基因的杂合和纯合型缺失，在其它肿瘤（如淋巴瘤、骨髓瘤和前列腺癌）中也检测到该区域的LOH。

  24. (3) 脆性位点 ①染色体脆性位点是一类细胞在不同的培养条件下、易于形成 染色单体或染色体裂隙、缺失、无着丝粒断片的特异性染色体 位点。脆性位点一般被认为是致突变剂、致癌剂作用的靶子， 可能增加个体对肿瘤的易感性。 ② 通过对人类已知的186个miRNA分子的染色体定位与数据库中 的相关位点进行比对分析，发现61个与脆性位点具有重叠性。 说明相当部分的miRNA定位在染色体的脆性位点，与肿瘤的 发生密切相关。 miR-125b-1定位于在染色体11q24脆性位点，在很多肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中存在表达下调或功能缺失。

  25. (4) 基因扩增 ① 通过对人类已知的186个miRNA分子的染色体定位与数据 库中的位点进行比对，发现15个位于染色体扩增区域。 1. 在大量实体瘤细胞中发现染色体7q23.2片段的扩增，引起miR-21的过表达，使抑癌基因PTEN下调，增强了肿瘤细胞的生存和生长能力。基因扩增是miRNA表达上调的一个重要分子遗传学机制。 (5) 染色体易位 ① 癌基因易位到miRNA下游，其转录受到miRNA启动子的控制。 8号和17号染色体的易位，导致Myc位于miR-142发夹结构下游，其转录受到miRNA启动子的控制。导致Myc表达上调，并引起B细胞的转化，增强B淋巴细胞增殖和抗凋亡活性。

  26. (四)恶性肿瘤microRNA的表观遗传学异常 1. 在癌细胞中，某些具有肿瘤抑制功能的miRNA被DNA过度 甲基化所沉默且关闭其启动子区域的染色质结构而抑制基因 转录。染色质修饰药物如DNA甲基化抑制剂和HDAC抑制剂。 5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) → 人类膀胱癌细胞 T24 （ miR-127 被甲基化沉默）→ miR-127 表达增加 2. miRNA可通过调节DNA甲基转移酶表达、维持细胞中 DNA甲基化或改变组蛋白修饰等多种途径而调节表观遗 传。

  27. (五)恶性肿瘤microRNA的合成异常 证据： （1）在肿瘤组织中，microRNA (miRNA) 整体水平表达下调， 说明肿瘤组织中miRNA在合成和成熟过程出现了异常。 （2）成熟miR-143 和miR-145在结肠癌中明显下调，其miRNA前体 Pre-miR-143和Pre-miR-145在肿瘤和正常组织中含量相似。 在乳腺癌中，miR-103/107↑→Dicer ↓ →miRNA ↓→侵袭\转移\EMT (Cell. 2010,141:1195–1207) 合成异常： （1）Drosha和Dicer表达和活性的异常 （2）由Ran-GTP/Export 5引起的pre-miRNA的转运异常。

  28. 四、恶性肿瘤microRNA的转录调控异常 （一）“转录因子-microRNA-靶基因”交互作用的分子网络 1．转录因子对microRNA初级转录产物的调控 大部分miRNA具有自己一套独立的顺式作用元件（启动子和增强子序列），受到上游一系列转录因子的调控。类似于蛋白编码基因的转录过程，这些转录因子通过与miRNA的顺式作用元件结合，调节miRNA在转录水平的表达。 2. microRNA对靶基因的调控 miRNAs与其靶基因3’-UTR的结合位点并不是完全互补，可以存在短的错配和G-U配对，因此，miRNA调控多个靶基因。同时，同一个靶基因又同时受到多个miRNA的调控。 miR-21 →TPM1、PCD4和PTEN ；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195 → bcl-2

  29. 3．“转录因子-microRNA-靶基因”构成复杂的分子网络 因此，一个转录因子可以调控多个miRNA分子，一个miRNA分子又同时受到多个转录因子的调控；同时，一个miRNA分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子的协同调控；它们之间组成了错综复杂的调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程的精细调控。

  30. （二）microRNA参与的信号转导通路 • 近30％的网络蛋白(总共159个)为miRNA的靶基因。 • 在人类基因组中, miRNA靶仅 占总基因数的17%左右，且处 于信号蛋白中的miRNA靶蛋白 的比例随信号传递的流向而递 • 增，即与上游配体、细胞表面 • 受体之类的上游信号元件相比, • miRNA更多地以下游信号转导 • 元件为靶（如转录因子）。

  31. 1．RAS通路 （1）RAS家族属于小G蛋白介导的胞内信号转导途径之一，激 活后可介导促进细胞增殖分化的信号转导 （2）RAS基因的3′-UTR包含多个let-7结合位点，是let-7的直接 靶基因。let-7的过度表达可导致RAS表达的下降，抑制肺 癌细胞生长和恶性生物学行为。 （3）miR-96通过阻止k-Ras的表达，抑制Akt信号、降低肿瘤细 胞的侵袭与运动能力、促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生 长，与肿瘤的发生发展负相关。 （4）miR-132的过表达能转录后调控p120RasGAP的表达水平，降 低Ras的活性。同时，miR-132具有促进细胞增殖、诱导血管 生成的功能，是Ras通路中重要的调节分子。

  32. let-7、miR-96、miR-132、miR-143 和 miR-145等参与了G蛋白介导的信号转导通路，通过转录后调控RAS通路中关键的靶分子的表达而影响Ras的活性，抑制肿瘤的发生发展。

  33. 2．PI3K/AKT通路 PI3K/AKT 信号通路及其下游反应为一条公认的重要信号转导通路。在大多数恶性肿瘤中，PI3K/AKT 信号通路处于激活状态，造成细胞的大量增殖。PTEN是一个非常重要的肿瘤抑制基因，在肿瘤中PTEN对PI3K/AKT途径有负调节作用，PTEN的突变或缺失与细胞的恶性转化和肿瘤的进展密切相关。 （1）在淋巴瘤中，miR-19的过度表达与PTEN蛋白的表达下调密切相关，提示前者可能为激活PI3K/Akt信号通路提供了一种转化机制。 （2）在肌肉组织中，miR-486通过其下游的直接靶分子PTEN和Foxo1a活化PI3K/AKT 信号通路。

  34. 信号转导通路： RAS、PI3K/AKT、 NF-κB、 Wnt、 Notch 、 JAKs-STATs 等 miRNA参与信号通路网与肿瘤的发生 miRNA与基因之间相互调控，共同突破平衡，才导致肿瘤的发生发展。作为肿瘤发生的重要信号通路，miRNA参与了几乎所有的肿瘤发生相关信号通路。

  35. 第四节 microRNA与肿瘤的诊断和治疗 肿瘤的分子诊断与治疗是分子医学的重要组成部分，已成为当前肿瘤研究领域的热点。 一些具有重要诊断和治疗价值的分子标志物已经在临床上得到了广泛的应用，但由于特异性、敏感性或靶向性等方面的因素，其临床应用仍然受到很大局限 。 由于miRNA在肿瘤多阶段发生过程中具有独特的表达特征和生物学功能，miRNA在肿瘤的分子诊断和治疗中具有广泛应用前景。

  36. 一、microRNA与肿瘤的诊断 (一) 肿瘤组织特异性表达标志物 miRNA 表达特征来对肿瘤进行分类，并且筛选能对肿瘤进行预后评估的miRNA标记。 1. 肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源 Lu等通过对多种组织来源肿瘤组织miRNA（约200个）表达谱进行归类，发现这些结果与肿瘤组织的胚胎来源一致。例如，内皮起源肿瘤，如直肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一类，血液系统来源的也被归为一类。而16000个蛋白编码基因的mRNA则不能将其聚在同一类。因此，肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源，这也与miRNAs 指导组织特异性发育功能相一致。

  37. (2) miRNA指导临床肿瘤诊断 许多的研究通过miRNA芯片技术系统研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血病等肿瘤组织与其正常组织中的差异表达，构建了相应肿瘤组织与正常组织差异miRNA表达谱，筛选出了一些具有临床诊断价值的分子靶标。 如，miR-221、miR-301和miR-376a诊断胰腺癌。 （3）miRNA非常稳定 福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库的建立成为可能。

  38. (二) 肿瘤血清标志物 血清的获得相对比较简单、对病人创伤少，因此肿瘤血清标志物越来越受到广大医学研究者青睐。 （1）miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以避免接触RNases，在严酷的环境条件下仍能保持稳定。 （2）miRNA在血浆和血清中稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值非常吻合。 第一个被发现的血清miRNA标志物是miR-21。Lawrie等人证实，弥漫性大B细胞淋巴瘤病人的血清miR-21水平很高，与淋巴瘤存活率呈负相关，是一个淋巴瘤预后预测的理想分子靶标。

  39. 二、microRNA与肿瘤治疗 （1）microRNA (miRNA)具有重要的生物学功能，参与肿瘤 的发生发展； （2）miRNA序列短，操控简单，基因药物容易导入到宿主体 内，从而逆转肿瘤的恶性生物学行为，达到治疗肿瘤的 目的。 （3）根据miRNA的生物学功能，可以从癌基因和抑癌基因的 角度设计针对性药物对肿瘤进行治疗。

  40. 针对致瘤性miRNA设计药物： 人工合成的反义寡聚核苷酸----抗miRNA寡聚核苷酸（AMOs）在灭活具有癌基因特性的miRNA表达，逆转肿瘤细胞恶 性生物学行为等方面取得了很大的突破。动物实验结果表明，与 胆固醇偶联的AMOs注射小鼠后，可以在小鼠的不同器官有效抑 制靶miRNA活性，抑制肿瘤的生长和恶性生物学行为。 • 针对抑瘤性miRNA设计药物： 利用病毒或者脂质体可以瞬时引入大量具有抑瘤基因的 miRNA （如let-7 家族） 。这些技术可以保证在某些组织特异性 的启动子控制之下，表达pre-miRNA 及其两侧序列，并且刺激内 源性的miRNA加工，产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。 生物公司针对 miR-21治疗肺癌。

  41. 五、microRNA研究方法 (一) miRNA基因的克隆和鉴定 1．直接克隆法 该方法通过建立富集miRNA的cDNA文库，进行测序及序列分析，排除已知序列后，剩下的新序列去检索基因组数据库，并用mFold软件分析其是否有发夹结构的前体。最后通过Northern印迹对其进行鉴定。 案例： ① 从人类、小鼠、拟南芥及水稻等生物的不同组织或细胞系，或不同发 育时期鉴定了几百种miRNAs; ② Lagos-Quintana等 2002年从小鼠的9个不同组织中鉴定了34个miRNA; ③ Suh等2004年从人类胚胎干细胞cDNA文库中鉴定了36个在人胚胎干细 胞中表达的miRNA。

  42. 2．建立在突变表型基础之上的正向遗传学筛选2．建立在突变表型基础之上的正向遗传学筛选 正向遗传学遵循的是从突变体表型分析到基因功能认识的思维方式，它首先关注的是具有某种缺陷的突变体。在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。 缺点： ① 筛选miRNA效率低； ② miRNA 单个缺失或突变只带来微小的表型差异甚至没有表 型差异造成许多miRNA被遗漏。 案例： ① 果蝇中的bantam、miR-14、miR-278和线虫中的lsy-6均是通过 这种方法鉴定出来的。

  43. 3．生物信息学分析 miRNA是从具有发夹结构的前体加工而来，而且有些miRNA序列或其前体序列在进化上比较保守。这些特点构成了生物信息学筛选miRNA基因的基础。根据某些miRNA基因保守结构的特点为基础设计计算机程序，扫描基因组序列以鉴定潜在的miRNA基因。 优点： ① 提高了miRNA鉴定的速度和效率； ② 预计不同物种中miRNA种类的总数 ； ③ 需要通过实验验证。

  44. （二）miRNA表达规律的研究 1. miRNA芯片技术 将目前已经克隆的miRNA或潜在miRNA制备成探针固定在尼龙膜或其它固相支持物上，然后与不同组别的总RNA或细胞器RNA杂交，通过信号的强弱比较探讨miRNA 的表达状况。 该方法类似于基因芯片技术，具有高通量、快速等优点，是目前疾病相关miRNA筛选常用的一种技术。 • qRT-PCR • Northern Blot • 原位杂交技术等

  45. (三) miRNA上游顺式作用元件和转录调控因子的筛选 • miRNA本身由基因组序列编码而来，因而在其对应gDNA的上游同样存在启动子、增强子或其它顺式作用元件。这些顺式作用元件作用距推测与蛋白编码基因具有相同的结构特点，因而通过生物信息学的手段容易预测。但是，生物信息学预测所得的结果终归要回到实验手段去证实。 • 报告基因分析法 • 2. 染色质免疫共沉淀 • 3. 序列步移法等

  46. miRNA相关转录因子的筛选是一个很重要的工作，这些转录因子组成一个调控网络，共同决定pri-miRNA或miRNA的表达状态。 • 通过生物信息学 • 对miRNA调控序列进行结构分析，预测可能存在的转录因子结合位点; • 2. 通过报告基因分析法; • 3. 染色质免疫共沉淀; • 4. 凝胶迁移率改变分析.

  47. (四) miRNA下游靶基因的筛选 • 生物信息学预测 • (1) The miRBase: http://microrna.sanger.ac.uk/ • (2) TargetScan : http: //www.targetscan.org • (3) PicTar : http://pictar.bio.nyu.edu/ • (4) miRbase: http://microrna.sanger.ac.uk • 2. 报告基因分析法 • 3’-UTR 或 潜在结合位点连接到报告载体 • (1) pMIR-REPORT™ miRNA Expression Reporter • ----Ambion (ABI) • (2) psiCHECK----promega

  48. 3. RISC免疫共沉淀 Ago2 (miRNA 和mRNA片段，经过PCR 扩增或芯片鉴定mRNA差异表达。建立特定miRNA, Ago2过表达的细胞模型， 芯片筛查差异表达基因。 miR-1→68种mRNA进入RISC→其中59种mRNA的3‘-UTR与miR-1互补 miR124 (419, 388) 5. miRNA-mRNA复合物分析法 以mRNA为模板，miRNA为引物，反转录延伸mRNA，形成5’-miRNA-cDNA-3’杂合分子，然后经过克隆和测序分析，筛查miRNA作用的靶基因。

  49. (五) miRNA生物学功能研究 miRNA涉及的生物学功能比较广，单就恶性肿瘤细胞而言，它可能会影响细胞增殖、分化、细胞周期、凋亡、代谢、药物敏感性、细胞运动、侵袭和转移能力等。因此，在探讨miRNA对这些肿瘤细胞的生物学功能时，可通过人为的造成这些miRNA在肿瘤细内的过表达或表达剔除，然后通过系列细胞生物学功能检测方法: 流式细胞术 细胞生长曲线绘制 细胞凋亡检测 软琼脂集落形成 细胞运动实验 划痕实验 基质胶侵袭实验 裸鼠成瘤等

  50. (六) miRNA研究总体思路

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