Download
bioassay guided fractination n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
BIOASSAY GUIDED FRACTINATION PowerPoint Presentation
Download Presentation
BIOASSAY GUIDED FRACTINATION

BIOASSAY GUIDED FRACTINATION

527 Vues Download Presentation
Télécharger la présentation

BIOASSAY GUIDED FRACTINATION

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. BIOASSAY GUIDED FRACTINATION DR. WARSINAH, M.SI., APT JURUSAN FARMASI FKIK

  2. BIOASSAY GUIDED FRACTINATION PEMISAHAN (FRAKSINASI) UJI AKTIVITAS

  3. EKSTRAKSI • Tanamanbasah • Senyawa target td rusakkarenapanas • Mudah • Contoh: • Enfloret .perendamantanamandenganminyakuntukdiambilminyakya) • Pengambilanminyakkemiri (dipres) • Simplesia (tanamankering) • Maserasi (direndamdenganpelartdalamwatutertentu) • Decocta (direndampakai air panas) • Perkolasi (dialiripelarutdanekstrakditamung) • Sohxletasi (dialiripelarut yang dipanaskanterlebihduludanekstrakditampungpadalabutempatpelarutdipanaskan

  4. Enfloret Tempat pemanas MINYAK kelapa Bahan pemanas

  5. MASERASI DIKERINGKAN DAN DISERBUK ditimbang 2/3 1/3

  6. DECOCTA AIR PANAS (MENDIDIH) 24 JAM

  7. perkolasi

  8. SOHXLETASI Tabung atas: pendingin spiral/liebig Tabung bawah: sampel Labu alas bulat: tempat pearut dan ekstrak Air masuk

  9. fraksinasi • Cair –cair> dengancorongpisah • Padatcair > perendaman • > kromatografikolom • > Kromatografi lapis Tipis • > kromatografikertas • > HPLC (High Performan liquid chromatografi)

  10. Cair- cair (corong pisah ) • Pelarut yang digunakantidakdapatcampurdenganpelarut yang digunakanuntukmengekstrak • contoh: pelarututkmengekstraketanol • senyawa yang akandiambilasamlemakmakapelarut yang digunakanadalahpelarut non polar seperti n-heksan, kloroform, ether ataudietylether

  11. Kromatografi lapis tipis UV 254 UV 366

  12. Kromatografi kolom Tinggi tabung : 60 cm Tinggi silika: 2/3 tabung Garis tengah Tabung: 8,6,4,2 & 1 cm Pelarut: tunggal atau campuran ( non polar ke polar)

  13. HASIL FRAKSI

  14. UJI AKTIFITAS • ANTI OKSIDAN : BHT ATAU DPPH • ANTIINFLAMSI: OEDEN KAKI TIKUS • ANTIBAKTERI: BAKTERI GRAM POSITIF ATAU GRAM NEGATIF • ANTIJAMUR : JAMUR CANDIDA ALBICAN • ASAM URAT: ASAM OSOLONAT • ANTIKANKER: INVITRO- SEL, INVITRO: TIKUS • ANTIDIABETUS MELITUS : TIKUS • ANTI ASMA: OTOT POLOS USUS SAPI

  15. Contoh bioassay guided fraktnation Pembuatan simplesia dan ekstrak Kulit batang B gymnorhiza Maserasi dengan metanol(3x24 jam) Diseleksi Dikeringkan Saring dan diuapkan simplisia Ditumbuk Ekstrak metnol serbuk

  16. 2. Fraksinasi fraksi metanol Fraksi metanol Fraksinasi degan n-heksan residu Fraksinasi dengan kloroform Fraksi larut n heksan residu Fraksinasi dengan Etilasetat Uapkan Fraksi larut kloroform residu Uji aktifitas Fraksi larut etil asetat Larut metanol

  17. CARA KERJA 1. FRAKSINASI fraki kloroform DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM Fraksi kloroform F1 F2 F3 F4

  18. 2. Pembuatan larutan uji saring Fraksi aktif dilarutkan 1,25% DMSO ditimbang Stoksampel 10 ug/ml Kadar 2 kadar 3 kadar 4 kadar 5 Kadar 1 18

  19. 3. Uji sitotoksik/ antiprolferatif Media sampel Sel Dokso rubisin Sel + sampel Sel+ doksorubisin Media+ sampel Media+ sel INKUBASI24 jam Elisa reader MTT INKUBASI 4 JAM, 37C Absorban REAGEN STOPER INKUBASI SEMALAM 19

  20. Contoh hasil uji aktifitas A. Ekstrak Metanol Kulit Batang B. gymnorhiza dan Aktivitas Sitotoksiknya Rendemen ekstrak metanol : 13,07%). ekstraksi pada tanaman Rhizopra mucronata menghasilkan ekstrak sebesar 9,71% (Diastuti, 2009), tanaman Avicinea oficinale sebesar 9,25% (Bayu, 2009) dan Ipomea pescaprae sebesar 7,58% (Handayani, 2008 IC50 sebesar 228,78 µg/ml

  21. Morfologi sel HeLa Gambar 5. Efek ekstrak metanol terhadap perubahan morfologi sel HeLa . Pengamatan morfologi sel pada jam ke 24 dilakukan dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 200x : kontrol sel (a), kontrol DMSO (b), perlakuan ekstrak metanol 500 µg/ml (c), 250 µg/ml (d) 125 µg/ml (e) dan 62,5 µg/ml (f), menunjukkan sel mati, mengapung, keruh, dan berbentuk bulat, menunjukkan sel hidup melekat didasar dan berbentuk daun

  22. Hasil partisi ekstrak metanol dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etil asetat B. Fraksinasi Ekstrak Metanol dan Aktivitas Sitotoksik

  23. Harga IC50 fraksi F1-F5 Aktivitas sitotoksik Efek fraksi n-heksan, kloroform, etil asetat dan residu terhadap viabilitas sel kanker HeLa dengan metode MTT

  24. Hasil Fraksinasi Fraksi Kloroform dengan Kromatografi Cair Vakum C. Fraksinasi Fraksi Kloroform dengan Kromatografi Cair Vakum

  25. Rf 0,52 Coklat Rf 0.51 Profil komatogram KLT fraksi F1-F5. Fase diam silika Gel 60 GF254 dengan fase gerak kloroform : etil asetat (6:4) dan dideteksi dibawah sinar UV254

  26. Uji aktivitas sitotoksik Harga IC50 fraksi F1-F5 Kurva efek perlakuan fraksi F1- F5 terhadap viabilitas sel HeLa. Sel kemudian diberi perlakuan fraksi F1-F5 dengan konsentrasi 500, 250, 125 dan 62,5 dan 31,25 µg/ml dan diinkubasi selama 24 jam. Profil viabilitas sel disajikan dari rata-rata ± Standart deviasi (SD) dari 3 perlakuan.

  27. D. Fraksinasi Fraksi F2 dan Aktivitas Sitotoksik Hasil pemisahan fraksi F2

  28. Profil kromatogram KLT fraksi gabungan (S1-S9), dibawah UV254 (a) dan UV366 (b)

  29. Efek sitotoksik fraksi S1-S9 terhadap sel Hela dan Harga IC50 Efek fraksi S1 - S9 terhadap viabilitas sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 µg/ml. Profil viabilitas sel menunjukkan dose dependent Harga IC50 pada perlakuan fraksi S1- S9 terhadap sel HeLa

  30. E. Fraksinasi Fraksi S3 dan Aktivitas Sitotoksik Fraksi gabungan dari hasil pemisahan fraksi S3

  31. coklat ungu Profil kromatogram KLT fraksi gabungan T1- T9 dibawah UV254

  32. Efek sitotoksik fraksi gabungan T1 - T9 terhadap viabilitas sel HeLa Nilai IC50 dalam µg/ml fraksi gabungan T1-T9 pada sel HeLa

  33. F. Fraksinasi Fraksi T4 dan Aktivitas Sitotoksik 1. Hasil pemisahan T4 2. Profil KLT I1, I2, dan I3 3. Aktivitas sitotoksik dilihat dari harga IC50 ungu

  34. Efek isolat I1 Efek isolat I2 Efek isolat terhadap viabilitas sel Hela Efek isolat I3

  35. G. Pemurnian Fraksi I2 Hasil pemurnian fraksi I2 menggunakan fase diam sephadex LH 20 dan fase gerak metanol Uji kemurnian dengan KLT Harga Rf isolat aktif pada fase diam silika gel GF254 dengan tiga fase gerak yang berbeda polaritasnya Kromatogram KLT isolat aktif yang telah dimurnikan. (a) fase gerak kloroform:etilasetat (6:4), (b) fase gerak n-heksan: etilasetat (3:7), (c) fase gerak n heksan: metanol (5:5)

  36. H. Aktivitas Biologis Isolat Aktif 1. Efek sitotoksik IC 50 = 4,13 µg/ml Efek isolat aktif terhadap viabilitas sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan 10, 5, 2.5, 1.25 dan 0.63 µg/ml

  37. 2. Efek antiproliferatif isolat aktif terhadap sel HeLa Efek antiproliferatif isolat pada berbagai konsentrasi terhadap sel HeLa pada berbagai waktu. • - Inkubasi 3x103 selHeLaselama 24 jam. • Waktupenamatan 0, 24, 28 dan 72 jam • Konsentrasiisolatmaupundoxorubibicinuangdignakan 1, 2 dan 4 µg/ml)

  38. 3. Pengaruh isolat terhadap siklus sel Hasil analisis siklus sel HeLa dengan perlakuan isolat (2 µg/ml) dan doxorubicin (2 µg/ml) pada pengamatan 24 jam dibanding sel kontrol Pengamatan siklus sel HeLa dengan flow cytometri setelah inkubasi 24 jam

  39. 4. Aktivitas Isolat pada Induksi Apoptosis sel HeLa a. Metode double staining sel Hela terlihat berwarna orange dengan bentuk yang tidak teratur yang mengindikasikan sel mengalami apoptosis Sel hidup berwarna hijau terang berbentuk daun kontrol Perlakuan isolat aktif Hasil pengamatan morfologi sel Hela dengan pengecatan DNA menggunakan akridine orange – etidium bromide

  40. b. Induksi apoptosis dengan metode Flowcytometri Pengamataninduksi apoptosis selHeLamenggunakanmetodeFlowcytometri. Kontrol (A), perlakuan doxorubicin 2 µg/mL (B) danperlakuanisolataktif 2,16 µg/mL (C). (Sh) selhidup, (an) selmatinekrosis, (ap) selmatisecara apoptosis Hasilanalisisinduksi apoptosis denganFlowcytometri

  41. 5. Pengamatan ekspresi protein a. Ekspresi P53 Perlakuan isolat Kontrol sel Perlakuan doxorubicin Efek perlakuan isolat aktif terhadap ekspresi p53 pada sel HeLa. Sel Hela ditanam sebanyak 5x104 sel/sumuran pada coverslips dalam plate 24. Selanjutnya diberi perlakuan isolat aktif maupun doxorubicin.