ENZIMI

1. Come funziona un enzima ENZIMI L’amilasi I. Marini, Riscoprire uno storico enzima: l’amilasi, La Chimica nella scuola, Aprile-Giugno 2007, pp. 103-110

2. AMIDO: il più importante materiale di riserva (glucosio) dei vegetali Cellula di tubero di patata con leucoplasti (amiloplasti) Leucoplasti: organelli delimitati da membrana contenenti amido

3. macromolecole di amido amilopectina

4. x 1015 ! amido glucosio L’amilasi è un enzima che catalizza le reazioni di idrolisi dell’amido (amilosio: catene non ramificate + amilopectina: catene ramificate) a molecole formate da una ad alcune unità di glucosio (glucosio, maltosio e oligosaccaridi). Questo enzima aumenta enormemente la velocità della reazione idrolitica: ca. 1015 volte!

5. AMILASI β-amilasi α-amilasi mondo vegetale mondo animale • amilasi della saliva • amilasi del succo pancreatico • endosperma dei semi consente all’embrione vegetale di utilizzare la fonte di glucosio accumulata come amido nel seme dalla pianta “madre” consente agli animali di utilizzare (digerire) la fonte di glucosio rappresentata dall’amido proveniente dai vegetali  

6. α-amilasi nei succhi digestivi degli animali

7. β-amilasi nel tessuto di riserva (endosperma) dei semi La germinazione a plantula presuppone la capacità da parte dell’embrione di “digerire” l’amido a glucosio.

8. Orzo (Hordeum vulgare) L'orzo è la sorgente più comune per gli zuccheri fermentabili utili alla birra.  I semi germinanti di orzo sono ricchi di β-amilasi.

9. Inibitori dell’amilasi: • faseolamina: difesa chimica nei confronti dei predatori (inibisce l’attività dell’amilasi presente nei succhi digestivi. Questo inibitore è per esempio contenuto nei fagioli.

10. Amido Glucosio Fehling Lugol Reazione oggetto di studio

11. amylopectin http://www.lsbu.ac.uk/water/hystah.html

13. blu Precipitato arancio Test di Fehling 7 Fehling A: 7.0 g di CuSO4 ·5H2O (solfato di rame penta idrato) in tanta acqua distillata da ottenere 100,0 mL di soluzione. Fehling B: 35 g di C4H4 O6KNa·4H2O (tartrato di sodio e potassio tetra idrato) e 10 g di NaOH (idrossido di sodio) in tanta acqua distillata da ottenere 100,0 mL di soluzione. acido 2S,3S-diidrossibutandioico

14. incolore viola Test di Lugol 8 Reattivo: 20 g di Ioduro di potassio (KI) e 12,7 g di Diiodio (I2) vengono sciolti in tanta acqua distillata da ottenere 1,0 L di soluzione. Diluire poi la soluzione 1 a 5 con acqua distillata. Ioduro di potassio (KI) Diiodio (I2) Acqua distillata

15. blu Precipitato arancio Fornello con acqua bollente ENZIMI Test di Fehling 7 1 2 Porre la provetta a bagnomaria in acqua bollente per al massimo 5 minuti 2 gocce di reattivo A + 2 gocce di reattivo B 10 gocce della soluzione incognita http://www.chemie.uni-regensburg.de/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-Fehling-d.htm

16. incolore viola 2 gocce di reattivo 8 gocce della soluzione incognita ENZIMI Test di Lugol 8

17. Esperimento 1: Glucosio dall’amido In ogni provetta: 2,0 mL tampone E (pH 7,0) + 400 mL di amido MESCOLARE von vortex – Dopo il trattamento dividere la miscela in due parti e procedere con il test Lugol e Fehling * Aggiungere una goccia di NaOH 5 M, prima del test di Fehling ** Prima dell’aggiunta questa soluzione di saliva/orzo va scaldata nel bagnomaria con acqua bollente per 5 minuti *** Prima dell’aggiunta questa soluzione di saliva/orzo va raffreddata in acqua e ghiaccio per 5 minuti

18. Domande: Spiega con quali criteri è stato assemblato l’esperimento! (quali sono le variabili che si sono volute controllare? Come è avvenuto questo controllo?) Quali sono le vostre previsioni circa l’esito dei vari esperimenti (1-8)? Motivate brevemente!

19. Compito: • Sviluppa un protocollo di laboratorio per indagare una delle seguenti domande: • Qual è l’influsso del pH sull’attività enzimatica? • Qual è l’influsso della temperatura sull’attività enzimatica? • Quale relazione esiste tra attività enzimatica e concentrazione del substrato? • Qual è l’effetto della faseolamina sull’attività enzimatica della a e b-amilasi? • Presentazione in power point (max 10 minuti) con: • Problema indagato • Descrizione e spiegazione dell’esperimento • Presentazione dei risultati ottenuti • Discussione: in che misura i dati permettono di trarre delle conclusioni per rapporto al quesito oggetto di indagine • Presentazione: • Martedì 15 dicembre 2009 dalle 9.05 alle 9.50 • Domanda preliminare • Che cosa si intende con l’espressione “attività enzimatica”? • Come si potrebbe misurare?

20. pH 30 s 60 s 90 s 120 s 150 s 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Esperimento 2: Attività enzimatica e pH Mettere in un’eppendorf 600 mL di tampone e 200 mL di amido. Saggiare il pH con la cartina tornasole Aggiungere 60 mL di saliva diluita 1 a 10 MESCOLARE von vortex e far partire immediatamente il cronometro! Ogni 30 secondi prelevare alcune gocce dalla soluzione e aggiungere una goccia di lugol Annotare il tempo entro il quale si ha il completo scolorimento Calcolare la velocità della reazione catalizzata (mg di amido idrolizzato in un minuto) per ciascun pH

21. Costruisci un grafico pH vs attività enzimatica. Quali conclusioni si possono trarre dall’esperimento? Spiega con quali criteri è stato assemblato l’esperimento! (quali sono le variabili che si sono volute controllare? Come è avvenuto questo controllo?)

22. T °C 30 s 60 s 90 s 120 s 150 s 0 25 37 90 Esperimento 3: Attività enzimatica e Temperatura Mettere in un’eppendorf 600 mL di tampone E (pH 7) e 200 mL di amido. Mettere in una seconda eppendorf 200 mL di saliva diluita 1 a 10. Immergere i due contenitori nel bagno termostatizzato e attendere almeno 5 minuti. Mescolare 700 mL della provetta 1 con 100 mL della provetta 2 MESCOLARE von vortexe far partire immediatamente il cronometro! Ogni 30 secondi prelevare alcune gocce dalla soluzione e aggiungere una goccia di lugol Annotare il tempo entro il quale si ha il completo scolorimento Calcolare la velocità della reazione catalizzata (mg di amido idrolizzato in un minuto) per ciascuna temperatura

23. Prendere i campioni tenuti a 0 °C e 90 °C, incubarli a 37 °C per 5 minuti e saggiare l’attività enzimatica con la stessa procedura. Costruisci un grafico T vs attività enzimatica. Quali conclusioni si possono trarre dall’esperimento? Spiega con quali criteri è stato assemblato l’esperimento! (quali sono le variabili che si sono volute controllare? Come è avvenuto questo controllo?)

24. Esperimento 4: Quale relazione tra concentrazione di substrato e attività enzimatica? Mettere in un’eppendorf 800 mL di tampone E (pH 7) e 80 mL della soluzione di amido. Aggiungere 30 mL di saliva diluita 1 a 10 MESCOLARE von vortex. Far partire immediatamente il cronometro! Ogni 15-20 secondi prelevare alcune gocce dalla soluzione e aggiungere una goccia di Lugol. Annotare il tempo entro il quale si ha il completo scolorimento. Calcolare la velocità della reazione catalizzata (mg di amido idrolizzato in un minuto) per ciascuna temperatura Amido mg/mL 15 s 30 s 45 s 90 s 105 s 0,85 1,25 1,90 2,60

25. Costruisci un grafico Attività enzimatica vs concentrazione iniziale di amido . Quali conclusioni si possono trarre dall’esperimento? Spiega con quali criteri è stato assemblato l’esperimento! (quali sono le variabili che si sono volute controllare? Come è avvenuto questo controllo?)

26. Esperimento 5: Inibizione enzimatica Preparare le seguenti 4 soluzioni 1 Mettere in un’eppendorf 300 mL di tampone E (pH 7), 30 mL di saliva diluita 1 a 10 e 100 mL della soluzione contenente la faseolamina. 2 Mettere in un’eppendorf 400 mL di tampone E (pH 7), 30 mL di saliva diluita 1 a 10. 3 Mettere in un’eppendorf 300 mL di tampone E (pH 7), 50 mL di estratto di orzo e 100 mL della soluzione contenente la faseolamina. 4 Mettere in un’eppendorf 400 mL di tampone E (pH 7), 50 mL di estratto di orzo . MESCOLARE von vortexelasciare incubare le 4 soluzioni per almeno 15 minuti Aggiungere 100 mL della soluzione di amido. Far partire immediatamente il cronometro! Ogni 30 secondi prelevare alcune gocce dalla soluzione e aggiungere una goccia di Lugol. Annotare il tempo entro il quale si ha il completo scolorimento. Calcolare la velocità della reazione catalizzata (mg di amido idrolizzato in un minuto) per ciascuna situazione

27. Paragona l’attività enzimatica nei quattro casi. Quali conclusioni si possono trarre dall’esperimento? Spiega con quali criteri è stato assemblato l’esperimento! (quali sono le variabili che si sono volute controllare? Come è avvenuto questo controllo?)

28. Altre soluzioni necessarie Acido cloridrico 5 M Idrossido di sodio 5 M Soluzione di amido: sciogliere 1,0 g in 100 mL di soluzione tampone E Soluzione di a-amilasi: raccogliere in un provettone la saliva (di una o più persone) Soluzione di b-amilasi: semi di orzo germinati da 2 o 3 giorni vengono omogenizzati con un mortaio e un pestello col tampone E ( circa 0,5 g di semi / mL di tmapone). Questo estratto va centrifugato per 5 minuti. Il sovranatante contiene l’enzima desiderato. Faseolamina dai fagioli: Prendere 2 o 3 fagioli, porli nel mortaio con il tampone E (0,3 g di semi / mL di tampone. Omogeneizzare e porre l’omogenato per 3 ore a 4 °C. Centrifugare per 15 minuti. Il sovranatante contiene l’estratto desiderto.

29. 1,45 g acido acetico 100 mL di acqua NaOH 1,0 M fino a pH desiderato poi acqua fino a 500 mL di soluzione Soluzioni tampone necessarie 500 mL 50 mM A pH = 4,0 B pH = 5,0

30. 3,45 g sodio Diidrogenofosfato NaH2PO4 · H2O 100 mL di acqua NaOH 1,0 M fino a pH desiderato poi acqua fino a 500 mL di soluzione Soluzioni tampone necessarie 500 mL 50 mM C pH = 6,0 D pH = 6,5 E pH = 7,0

31. 3,03 g di Tris 100 mL di acqua HCl 1,0 M fino a pH desiderato poi acqua fino a 500 mL di soluzione Soluzioni tampone necessarie 500 mL 50 mM F pH = 7,5 G pH = 8,0 H pH = 9,0

32. Esperimento 1: Glucosio dall’amido In ogni provetta: 2,0 mL tampone E (pH 7,0) + 400 mL di amido – Dopo il trattamento dividere la miscela in due parti e procedere con il test Lugol e Fehling * Aggiungere una goccia di NaOH 5 M, prima del test di Fehling ** Prima dell’aggiunta questa soluzione di saliva/orzo va scaldata nel bagnomaria per 5 minuti

33. Quali conclusioni si possono trarre dall’esperimento? Spiega con quali criteri è stato assemblato l’esperimento! (quali sono le variabili che si sono volute controllare? Come è avvenuto questo controllo?)