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Enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione. riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi , cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.

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Enzimi di restrizione

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Presentation Transcript

  1. Enzimi di restrizione • riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. • Queste sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.

  2. -Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato: EcoRI E = genere Escherichia co = specie coli GAATTC R = ceppo RY13 CTTAAG I = prima endonucleasi isolata BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens GGATCC H = ceppo H CCTAGG I = prima endonucleasi isolata Simmetria binaria

  3. Tipi di taglio • -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO • Es. SmaI • 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’ • 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’ • -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: • -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE) • -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE) • Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) • 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ • 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’ • Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) • 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’ • 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’

  4. Quante volte taglia un enzima • Probabilità di trovare un sito di restrizione: • basi probabilità • 4 (1/4)4 = 1/256 • 5 (1/4)5 = 1/1024 • 6 (1/4)6 = 1/4096 • 8 (1/4)8 = 1/65536

  5. DNA ligasi

  6. defosforilazione

  7. Gel elettroforesi

  8. Southern blot • Il Southern Blot è una tecnica che permette di identificare la presenza del frammento di DNA che a noi interessa tra una miscela di tantissimi frammenti.

  9. Chimica del DNA • Soluzione viscosa a pH 7 • Diminuzione viscosità a pH estremi o a T> 80°C • Denaturazione ( aumento D.O) • Rinaturazione (diminuzione D.O.) • Formazione di ibridi anche tra catene di specie diverse • I nucleotidi vanno incontro a trasformazioni chimiche (mutazioni)

  10. DENATURAZIONE E RINATURAZIONE La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei due filamenti complementari che lo costituiscono. Il processo inverso è detto rinaturazione.

  11. Curva di fusione 1.3 1.2 1.1 1.0 Grado di denaturazione (%) 50 0 Assorbanza a 260 nm Tm 40 60 80 100 Temperatura (°C) ANALISI FISICA Effetto ipercromico: Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA. Temperatura di melting (Tm): Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%. Maggiore è G+C, maggiore è Tm.

  12. Curva C0t Effetto ipocromico: Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA. Parametri che influenzano la rinaturazione: 1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume 2) Tempo La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA 0 50 100 DNA a rinaturazione rapida Rinaturazione (%) DNA a rinaturazione lenta -2 -1 0 1 2 3 4 5 Log Cot CINETICA di RINATURAZIONE

  13. forma A forma B forma Z Senso elica destrorsa destrorsa sinistrorsa Diametro 26 A 20 A 12 A Coppie di basi per ogni giro di elica 11 10.5 12 Distanza tra basi 2.6 A 3.4 A 3.7 A Piegamento basi rispetto all’asse dell’elica 20° 6° 7° Conformazione dello zucchero C-3’ endo C-2’ endo C-2’ endo per pirimidine C-3’ endo per purine Conformazione Legame glucosidico anti anti anti per pirimidine sin per purine

  14. % ss DNA rimanente Cot Fig. 13 Curva di Cot

  15. SONDE E MARCATURA • La sonda è un frammento specifico di DNA (o RNA), reso radioattivo, capace di riconoscere una sequenza complementare di DNA o RNA in una popolazione di tanti frammenti.

  16. Metodi di marcatura • Nick transaltion • Random priming • Marcatura terminale

  17. 3’OH 3’OH 3’OH 3’OH -5P’ -5P’ -5P’ -5P’ nick con un -OH disponibile 5’P -3’OH L’attività 3’5’ esonucleasica rimuove il nucleotide 5’P -3’OH L’attività 5’3’ polimerasica sostituisce il nucleotide 5’P -3’OH L’attività 5’3’ esonucleasica sposta il nick verso il 3’ 5’P -3’OH

  18. -3’OH 5’P 3’OH -5P’ Denaturazione ed appaiamento degli esanucleotidi casuali 5’P 5’P -3’OH -3’OH 3’P 5’OH Enzima Klenow + dNTP* 3’P 5’OH

  19. 5’- -3’ DNA 3’- -5’ G C G C A A G 5’- -3’ DNA denaturazione 3’- -5’ C G C G T T C 3’-TAGCAG-5’ aggiunta di inneschi esanucleotidici  3’-GCATGC-5’ taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide mediante la DNA polimerasi I 5’-TGCAGT-3’ ibridizzazazione 5’-GCATAC-3’ G G C A A G Pol I 5’- -3’ -5’ 3’- -3’ 5’- C G C G T T C 3’-TAGCAG-5’ 3’-TAGCAG-5’ riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del nucleotide successivo 32P-dCTP 5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’ 3’- -5’ G C C A A G -3’ 5’- dATP Frammento di Klenow, dNTP -5’ 3’- 32P-dCTP C G C G T T C dTTP dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’ dGTP Sintesi DNA -3’ 5’- G C G A A G 5’- -3’ 3’-TAGCAG-5’ 3’-TAGCAG-5’ 3’- -5’ DNA sonda marcato C G C G T T C 5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’ 32P-dCTP 3’- -5’                    denaturazione G C G C A G 5’- -3’ 3’- -5’ C G C G T T C MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale NICK TRANSLATION Spostamento dell’incisione 3’- -5’

  20. 3’OH 5’P 3’OH 5’OH 3’OH 5’P -5P’ -3’OH -5’OH -3’OH -5P’ -3’OH Trattamento con fosfatasi Polinucleotide chinasi+ [32P]dATP

  21. I tipi di marcatura non radioattiva sono essenzialmente: • -marcatura isotopica diretta(incorporazione di nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di una certa l); • -marcatura indiretta( associazione tra una molecola indicatrice e un precursore nucleotidico). • I sistemi più usati sono: • -Il sistema biotina-streptavidina -La digossigenina

  22. O Uracile NH HN O Uracile HN S dUTP Biotina N O Desossiribosio Trifosfato PRINCIPIO DELLE SONDE NON RADIOATTIVE: Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina B B B B C U C G A G A U G U C A U G A G C T C T A C A G T A DNA sonda DNA target Ibridazione del DNA sonda col DNA bersaglio dei cromosomi (A) Avidina-enzima (B) Avidina-fluoroforo E = molecole reporter fosfatasi alcalina o b-galattossidasi E A F A E A F A B B B B F = molecole reporter A U G U C T A C A G A U G U C T A C A G

  23. Ibridazione • L’ibridazione è quel processo per cui due filamenti di DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido (doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione di legame idrogeno per un certo numero di basi complementari. • L’ibrido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA. • L’ibridazione può avvenire anche tra molecole di DNA non perfettamente complementari. • Sono molto importanti le condizioni sperimentali.

  24. Condizioni stringenti • Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni sperimentali che permettono la migliore ibridazione. • Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): • maggiore Temperatura • minore concentrazione salina • presenza di denaturanti chimici • Condizioni di ibridazione menostringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): • minore Temperatura • maggiore concentrazione salina • assenza di denaturanti chimici

  25. Mappe di restrizione in diagnostica

  26. DIMENSIONE dei FRAMMENTI (Kb) TRATTAMENTO INTERPRETAZIONE Nessuna digestione 9 9 2 + 7 Enzima A 2 7 A B A 3 6 Enzima B 3 + 6 B A 3 6 A B A 1 + 2 + 6 2 1 6 Enzima A+ B B 2 + 3 + 4 2 4 3 ...MAPPATURA di RESTRIZIONE

  27. Sequenziamento con isotopi radioattivi a = adenina c = citosina g = guanina t = timina g t a c g t a c g t a c g t a c MICROSATELLITE ripetizione: adenina e citosina acacacacacacacacacacacacacacac dinucleotide :(ac)15

  28. 1) ESTRAZIONE DEL DNA Sangue Peli Seme DNA Doppia Elica • 2) PCR • Polymerase Chain Reaction Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo 3 paia di cromosomi omologhi 3) ELETTROFORESI

  29. Sequenziatore Automatico Elettroferogramma di un campione con 12 microsatelliti Immagine Computerizzata dell’ elettroforesi GENOTIPO: 263/263 PADRE MADRE GENOTIPO: 263/277 DIAGNOSI POSITIVA FIGLIO GENOTIPO: 263/263 Profilo genetico di un campione FIGLIO GENOTIPO: 263/277

  30. PADRE GENOTIPO: 128/140 PADRE GENOTIPO: 263/263 128 140 263 GENOTIPO: 128/146 MADRE GENOTIPO: 263/277 MADRE 128 146 263 277 FIGLIO GENOTIPO: 128/128 128 GENOTIPO: 263/263 FIGLIO 263 FIGLIO GENOTIPO: 124/128 124 128 GENOTIPO: 263/277 FIGLIO FIGLIO 263 277 GENOTIPO: 128/128 128 DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA

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