Download
1 / 71
720 likes | 1.65k Vues
De afsterving van micro-organismen. . Studie-informatie.
E N D
De afsterving van micro-organismen . C.M.Wiersema Friesland College Laboratoriumtechniek
Studie-informatie • In deze presentatie zie je een samenvatting over de afsterving bij micro-organismen als ze aan een schadelijke invloed worden blootgesteld. Het laat je in vogelvlucht zien wat er in de theorie staat. Alle oefeningen staan er niet in! Ook de bepalingen staan er slechts beknopt in, dus raadpleeg ook de website
Inleiding • In veel gevallen is de aanwezigheid van micro-organismen ongewenst. Micro-organismen zijn de oorzaak van voedselinfectie of voedselvergiftiging. Ze veroorzaken bederf en dus verlies aan opbrengsten. In een ziekenhuis zijn steriele materialen nodig. Op het laboratorium zijn steriele voedingsmedia en glaswerk nodig om betrouwbare resultaten bij het onderzoek te krijgen.De bestrijding van micro-organismen is dus belangrijk. In dit hoofdstuk wordt dit besproken.
Sterilisatie • is het zodanig behandelen van materiaal dat er na afloop geen levende (d.w.z tot groei in staat zijnde) micro-organismen meer aanwezig zijn. C.M.Wiersema Friesland College Laboratoriumtechniek
Desinfectie • is het zodanig behandelen van materiaal dat na afloop ervan het materiaal geen ziekte (infectie) veroorzaakt. In dit geval hoeven niet alle micro-organismen gedood worden maar worden ze wel zodanig in aantal verminderd dat het materiaal veilig gebruikt kan worden. • Desinfectie vindt plaats als sterilisatie niet haalbaar is: Het materiaal is niet bestand tegen sterilisatie. • Ook kan sterilisatie niet zinvol zijn: Het materiaal wordt direct na behandeling weer blootgesteld aan besmetting.
De afstervingscurve • Wanneer een product een voor micro-organismen schadelijke behandeling ondergaat zullen de aanwezige micro-organismen afsterven.In welke mate dit gebeurt en met welke snelheid kan men aflezen in een afstervingscurve,hier onder staat er een a fgebeeld:
Waarom halflogaritmisch? • Let op het betreft hier een half-logaritmische grafiek. • Het aantal micro-organismen op de verticale as is logaritmisch weergegeven! We zien dat er op deze wijze een rechte lijn ontstaat, de waarden zijn nu goed af te lezen...
Wanneer is er sprake van zo’n afstervingslijn? • Een vergelijkbare afsterving vindt behalve bij verhitting ook plaats bij andere schadelijke handelingen zoals: • Bestraling • Desinfectie
Leeropdracht Vul onderstaande tabel in (zie leeropdrachten) door uit de grafiek de waarden af te lezen.
Opdracht Vul de onderstaande tabel in:
Leeropdracht De decimale reductietijd is de tijd nodig om 90% van de bacteriesporen te laten afsterven. • Wat is de decimale reductietijd ? , lees dit af uit de grafiek • Wanneer zijn er 0 micro-organismen?.
De decimale reductietijd verschilt per behandeling • Hoe schadelijker de behandeling, hoe korter de decimale reductietijd:. • Hoe hoger de temperatuur, hoe korter de decimale reductietijd. • Hoe geconcentreerder het desinfectiemiddel hoe korter de decimale reductietijd • Hoe hoger de dosis straling hoe korter de decimale reductietijd
Oefenopgave: • Op tijdstip 0 zijn er 106 micro-organismen per ml in een zojuist gemaakte (100ml) fles bouillonagar. D121 = 1 minuut. • Hoelang moet een bij 121ºC verhit worden om 1 spore op 1000 flessen (van 100 ml) over te houden ? Als er één spore per 1000 flessen aanwezig is kun je ook zeggen dat er een kans van 1 op 1000 is dat je na sterilisatie een “mislukte” fles hebt.
Uitleg oefenopgave:Inleiding • Bij beide onderstaande methoden om de opgave te maken moet je erop letten dat de eenheden op elk tijdstip gelijk zijn. Als je begint met aantal micro-organismen per ml, dan moet je dat ook bij het eindresultaat van de verhitting doen. Dus niet 1 spore op 1000 flessen maar noteren hoeveel sporen er per ml zijn!
Methode 1 • Met een grafiek • Maak een grafiek waarbij je log aan micro-organismen uitzet tegen de tijd. Je kunt een grafiek maken omdat je op één tijdstip het aantal micro-organismen weet en je weet de decimale reductietijd. Dus je kunt ook een tweede punt tekenen, bijvoorbeeld 1 minuut later zijn er 105 sporen per ml. Door deze twee punten trek je een rechte lijn en klaar is je grafiek. In deze grafiek mag het aantal micro-organismen ook beneden de 0 dalen! Sterker nog! Het moet zelfs. Je start met 106 micro-organismen per ml en je gaat toe naar 1 spore op 100.000 ml. En dat is gelijk aan 10-5 spore per ml. In de grafiek zie je dan dat deze reductie van 106 maar 10-5 11 minuten duurt.
Methode twee: • Kijk naar het aantal decimale reducties dat plaats vindt, dat is gelijk aan de “afname van de exponent”, deze daalt van +6 naar –5 = 11 decimale reducties. Je weet dat 1 decimale reductie 1 minuut duurt, . 11 decimale reducties dus 11 minuten.
Factoren die het afstervingsproces beïnvloeden • Het eindresultaat dat is het aantal levende micro-organismen na afloop van een schadelijke behandeling is zowel bij sterilisatie als desinfectie afhankelijk van een groot aantal omstandigheden.
De dosis • Bijvoorbeeld de hoogte van de verhittingstemperatuur bij sterilisatie en de concentratie van het desinfectiemiddel bij desinfectie of de hoeveelheid straling bij het doorstralen van materialen. • Zo heeft het verhogen van de temperatuur een zeer groot effect. • Men moet echter ook rekening houden met de hitteresistentie van het te steriliseren product. Zo is verhitting altijd schadelijk voor een voedingsmedium en zal men deze altijd zo kort en laag mogelijk verhitten
Beginconcentratie • Het spreekt vanzelf dat bij een hogere beginconcentratie het eindresultaat van een verhitting slechter is dan bij een lagere concentratie. Hetzelfde geldt ook voor desinfectie en andere behandelingen die micro-organismen moeten laten afsterven
Het aantal micro-organismen aan het begin • Het spreekt vanzelf dat bij een hogere beginconcentratie het eindresultaat van een verhitting )bij een bepaalde tijd) slechter is dan bij een lagere beginconcentratie. Hetzelfde geldt ook voor desinfectie en andere behandelingen die micro-organismen moeten laten afsterven.
De omgeving waarin de micro-organismen zich bevinden • Er zijn omstandigheden die het afstervingsproces gunstig beïnvloeden en andere omstandigheden die het afstervingsproces juist vertragen.
Omstandigheden die het afstervingsproces gunstig beïnvloeden. • Zo vindt de afsterving veel sneller plaats wanneer de verhitting onder vochtige omstandigheden plaatsvindt. (Weet je ook waarom?) • Ook een lage pH of andere voor micro-organismen ongunstige omstandigheden maken de micro-organismen gevoeliger voor een schadelijke behandeling.
Omstandigheden die het afstervingsproces nadelig beïnvloeden • de aanwezigheid van vuil (organische materiaal) een storende factor bij het desinfectieproces. Het desinfectiemiddel reageert dan ook met dit vuil wat ten koste gaat van de reactie van het middel met de aanwezige micro-organismen. Ook zit het vuil vaak om de micro-organismen heen waardoor ze beschermd worden. • Gevriesdroogde micro-organismen zijn zeer resistent tegen verhittingsprocessen.
Van groot belang is de resistentie van het ongevoeligste micro-organisme. Bij verhitting betreft het dan de sporevormers. Bij desinfectie is het soort micro-organisme ook van belang.Zo werken lang niet alle stoffen tegen sporenvormers en schimmels en gisten. Ook Pseudomonas is berucht om zijn resistentie tegen bactericide middelen. Gevoeligheid van het micro-organisme
Hitteresistente bij sporenvormers • Binnen de groep van de sporevormers loop de hitteresistentie zeer sterk uiteen: De hitteresistentie van de bacteriespore verschilt sterk per bacteriesoort. In de volgende tabel is dat te zien.
Verschillende sterilisatiemethoden. • Op het laboratorium worden materialen en voedingsbodems vooral door verhitting gesteriliseerd. • Hittegevoelige stoffen moeten (in oplossing) door filtratie van de aanwezige bacteriën worden ontdaan.
Er zijn twee apparaten waarin de sterilisatie door verhitting plaatsvindt:De droogsterilisator , een hete lucht ovenDe autoclaaf, een grote snelkookpan waarin water onder druk wordt verhit waardoor oververhitte stoom ontstaat.
Toepassingen van de droogsterilisator • De droogsterilisator, in feite een gewone hete lucht oven, wordt gebruikt voor hittebestendige materialen van glas en metaal. Ook watten en papier kunnen tegen de sterilisatietemperatuur. • Waterige vloeistoffen kunnen hierin niet gesteriliseerd worden: ze verdampen alleen maar. • Olie wel, echter bij 121C in verband met de veiligheid. • Andere materialen zoals kunststoffen zijn vaak niet bestand tegen de hoge sterilisatie temperatuur die nodig is in een droogsterilisator.
De autoclaaf • Dit is een pan die na verwijdering van alle lucht luchtdicht wordt afgesloten. Vervolgens veroorzaakt de aanwezige stoom een overdruk. Hierdoor stijgt het kookpunt van water en kunnen temperaturen boven de 100ºC worden bereikt. Het gevolg is dat ook de sporen afsterven. Voorwaarde bij dit proces is dat er geen lucht meer in de afgesloten ruimte aanwezig is. Is deze wel aanwezig dan is er heerst er een lagere temperatuur dan bij 100% stoom het geval is:zie volgende tabel.
Conclusie: • Met lucht is er een veel slechter sterilisatieresultaat terwijl de drukmeter op de autoclaaf wel de juiste druk aangeeft!
Toepassingen van de autoclaaf • Met de autoclaaf worden hittebestendige vloeistoffen en oplossingen gesteriliseerd. Voorwaarde is wel dat stoom erin kan doordringen, zo kan olie niet in de autoclaaf gesteriliseerd worden. Ook voorwerpen die niet tegen de hoge temperaturen van de droogsterilisator kunnen worden in de autoclaaf gesteriliseerd. Leeg glaswerk wordt voorzien van een druppeltje water ( om stoom in het glaswerk te laten ontstaan).
Het temperatuurverloop in de autoclaaf • Kijken we naar de temperatuur in de autoclaaf nadat de verwarming aan is en de lucht verwijderd dan zien we het volgende:
De eerste fase:opwarmtijd omgeving • De opwarmtijd van de omgeving., dit is de tijd nodig om de inhoud van de pan, dit is de omgeving van het voorwerp, dus de stoom, op de gewenste temperatuur brengen.De lengte ervan hangt af van de (grootte van de) autoclaaf en de verwarmingscapaciteit.
De tweede fase ; opwarmtijd voorwerp • .De opwarmtijd van het voorwerp, dit is de tijd nodig om het voorwerp op de gewenste temperatuur te brengen. Deze is afhankelijk van de lading in de autoclaaf, de hoeveelheid materiaal, maar vooral van het volume van het te steriliseren medium. Hoe kleiner de porties hoe korter de opwarmtijd. Het duurt korter om het centrum van. een fles met 1 liter medium op temperatuur te krijgen dan een buisje met 10 ml medium.
Fase drie: minimale sterilisatietijd • .De werkelijke sterilisatietijd, dit is de tijd die nodig is om het gewenste sterilisatieresultaat te bereiken, het wordt ook wel de minimale sterilisatietijd genoemd. Dit is de sterilisatietijd die berekend wordt en nodig is om een gewenst eindresultaat te bereiken.
Fase twee en drie samen: werkelijke sterilisatietijd • Fase 2 en 3 samen zijn de totale sterilisatietijd, dus de tijd vanaf het moment dat de pan op druk is tot het moment dat de verwarming wordt uitgezet.
Fase vier: afkoeltijd • de afkoeltijd, wat opvalt is dat de omgeving sneller afkoelt als het voorwerp, zo kan het zijn dat de omgeving al kouder is dan 100C en het voorwerp nog warmer dan 100C.
Gevaren van de autoclaaf Een apparaat waarin sprake is van overdruk kan gevaarlijk zijn :op school zijn er al verschillende keren ontploffingen geweest door onvoorzichtig handelen, • Maak een autoclaaf (snelkookpan) pas open als de druk uit zich zelf gedaald is: niet het ventiel verwijderen of op andere manieren stoom laten ontsnappen! • Vervolgens voorzichtig openen en de flessen eruit nemen: handschoenen aan en bril op!
Er heerst onderdruk in het flesje, oorzaak onderdruk in het flesje en daardoor een lager kookpunt. De onderdruk ontstaat doordat de lucht verwijderd is en de waterdamp gecondenseerd Oplossing: bij de vlam het flesje openen De vloeistof is heter als 100ºC, oorzaak snellere afkoeling omgeving als het voorwerp. Oplossing :rustig laten afkoelen. Niet op een koud oppervlak of onder koud water laten afkoelen Wat te doen met kokende vloeistoffen? Er zijn twee oorzaken mogelijk :
Hoe lang steriliseren? • Dit hangt vooral af van het hoeveelheid vloeistof in de te steriliseren flessen/ buizen: :
De praktijk • Steriliseer altijd het medium in zo klein mogelijke volumes : • het voorkomt onnodig lang verhitten wat de kwaliteit van het medium aantast. • Je hoeft het na afloop niet te verdelen (op steriele wijze!) over de buizen (moet je dan ook apart steriliseren!) C.M.Wiersema Friesland College Laboratoriumtechniek
Autoclaaf en droogsterilisator:de verschillen • Hoewel beide apparaten door verhitting voorwerpen steriliseren zijn er toch verschillen. Het betreft: • De toepassingen. In de droogsterilisator worden geen waterige vloeistoffen zoals verdunningsvloeistoffen en media gesteriliseerd. • De sterilisatietemperatuur, deze is veel hoger bij de droogsterilisator. • De sterilisatietijd, deze is bij de droogsterilisator een stuk langer dan bij de autoclaaf. C.M.Wiersema Friesland College Laboratoriumtechniek
Waarom moet droogsteriliseren zoveel langer en heter? • De oorzaak is de wijze van verhitten: • Bij de autoclaaf wordt stoom gebruikt. Deze verhitting in aanwezigheid van water is veel effectiever dan droog verhitten zijn doordat micro-organismen dan(biomoleculen zoals eiwitten en DNA) veelgevoeliger zijn De eiwitten kunnen met water gehydrolyseerd worden. • Bij droge verhitting worden de eiwitten geoxydeerd wat meer energie kost. Daarnaast is de warmte-overdracht door middel van stoom een stuk sneller dan de warmte-overdracht door middel van lucht. C.M.Wiersema Friesland College Laboratoriumtechniek
Controle van de producten, hierbij worden aantal gesteriliseerde producten op steriliteit onderzocht:steriliteitcontroles . Men kan nooit alle producten onderzoeken, het kan dus zijn dat de onderzochte producten steriel zijn, maar een of meer van de niet onderzochte producten niet! Controle van het sterilisatieproces, hierbij wordt het proces gecontroleerd,sterilisatiecontrole, uitgaande van de gedachte dat als het proces goed verloopt de producten automatisch goed van kwaliteit zijn. Hoe weet je zeker of iets steriel is?
Steriliteitcontrole • Bij de steriliteitscontrole worden een aantal producten onderzocht op de aanwezigheid van (overlevende) micro-organismen. Het principe is eenvoudig, men probeert elk (beschadigd) micro-organisme ,al is het er maar één, te laten groeien. De beoordeling van de proef is minder eenvoudig ,er moeten om juiste conclusies te kunnen trekken de nodige controles zijn meegenomen.
Uitvoering steriliteitscontrole • Hiertoe brengt men het product in een rijk vloeibaar medium, zodat ook veeleisende micro-organismen kunnen groeien en beschadigde micro-organismen (wat na verhitting meestal het geval is) zich kunnen herstellen. Daarna vindt incubatie plaats, een aantal producten onder aërobe omstandigheden en een aantal producten onder anaërobe omstandigheden. • Na de incubatie wordt op groei beoordeeld.
