Disciplina : Toxicologia Geral

1. Cromatografia em Fase Gasosa (GC), Cromatografia Líquida (HPLC) e Espectrometria de Absorção Atômica em AnálisesToxicológicas Disciplina: Toxicologia Geral

2. Cromatografia Planar Coluna Camada delgada Gasosa Líquida Papel CROMATOGRAFIA A Cromatografia é uma técnica analítica onde os componentes a serem separados são distribuídos entre uma fase móvel e uma fase estacionária. CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

3. CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA GC - GAS CHROMATOGRAPHY Fase móvel : gás de arraste (hélio, hidrogênio, nitrogênio) Fase estacionária: coluna cromatográfica - Substâncias que podem ser analisadas por GC: gases, substâncias voláteis e termicamente estáveis. Exemplos: etanol, metanol, cocaína, tolueno, benzeno, anfetaminas, praguicidas.

4. ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE GC 5 2 6 3 4 1

5. 1) Fonte de gás de arraste em um cilindro de alta pressão - A escolha do gás de arraste (fase móvel) depende de certos fatores como preço, disponibilidade, pureza e tipo de detector utilizado. Também deve ser um gás inerte. Associado a fonte de gás estão os reguladores de pressão e os medidores de vazão que permitem controlar e monitorar o escoamento do gás de arraste: a eficiência da técnica varia com a vazão do gás (fluxo).

6. 2) Sistema de injeção de amostra - A amostra líquida é introduzida com a ajuda de uma microseringa de vidro. A agulha penetra uma borracha de silicone que é um septo auto-selante. A utilização da seringa, de modo ideal, permite uma reprodutibilidade da técnica. A temperatura do injetor deve ser tal que o líquido amostral seja rapidamente vaporizado sem haver decomposição térmica (próximo ao ponto de ebulição do componente menos volátil). Temperaturas comuns de análise são da ordem de 200-300C.

7. 2) Sistema de injeção de amostra “split” “splitless”

8. Coluna cromatográfica gás gás gás DETECTOR 3) Coluna: A separação efetiva dos componentes da amostra é realizada na coluna cromatográfica onde o tipo e a quantidade da fase estacionária são fatores importantes para se ter a eficiência desejada.

9. 3) Coluna: De acordo com a natureza da fase estacionária, é possível dividir-se a cromatografia em fase gasosa em: A) Cromatografia gás-líquido (CGL) ou partição: a fase estacionária é uma película delgada líquida não-volátil a qual recobre um sólido inerte denominado suporte. A base para a separação cromatográfica é a distribuição da amostra dentro e fora desta película, ou seja, a partição da amostra entre a fase móvel e a fase estacionária líquida. B) Cromatografia gás-sólido (CGS) ou adsorção: a fase estacionária é um sólido de grande área superficial, usualmente um adsorvente como carvão vegetal, sílica-gel ou peneira molecular. Empregado na separação de gases como nitrogênio, oxigênio, monóxido de carbono, etc.

10. 3) Coluna: Tipos de coluna: - Empacotada - Capilar Em colunas capilares temos uma maior eficiência, uma melhor resolução cromatográfica e um tempo de análise menor.

11. 3) Coluna: Eficiência da coluna pode ser calculada pelo número de pratos teóricos (N): N = 16 (TR / Wb)2 = 5,545 (TR / Wh) 2 TR = tempo de retenção Wb = largura da base do pico Wh = largura a meia altura do pico Um prato teórico é definido como sendo um equilíbrio de distribuição do soluto entre as duas fases; quanto maior o valor de N, mais equilíbrios existirão e a separação será maximizada.

12. 3) Coluna: Os parâmetros operacionais de uma coluna podem ser melhor avaliados por seu efeito sobre a altura equivalente a um prato teórico (AEPT ou H)que corresponde à razão entre o comprimento da coluna, L (em cm) e o número de pratos teóricos, N. H = AEPT = L /N Portanto, H é o comprimento necessário de uma coluna para gerar um prato teórico; quanto maior N, menor será H e mais eficiente será a coluna.

13. 3) Coluna: Resolução: A Resolução (R) é uma medida quantitativa da separação de dois picos consecutivos, sendo determinada por dois fatores: TR e Wb. R = 2 TR / Wb1 + Wb2

14. 3) Coluna: Resolução:

15. 4) Forno: -Temperatura -Análise isotérmica: quando a análise em cromatografia em fase gasosa é realizada com forco mantido à temperatura constante desde o início até o final. -Temperatura programada: a temperatura muda durante o decorrer da análise A) Balístico B) Linear C) Multilinear

16. 4) Forno:

17. 4) Forno:

18. 5) Detectores: A) Detector de Ionização de Chama (FID) B) Detector de Condutividade Térmica (TCD) C) Detector de Nitrogênio-Fósforo (NPD) D) Detector de Captura de Elétrons (ECD) Obs: Em geral utiliza-se temperaturas mais elevadas no detector do que no forno, para evitar condensação de substâncias no detector (contaminação).

19. 5) Detectores: A) Detector de Ionização de Chama (FID) -Íons são gerados na chama e detectados. -Detecta substâncias ionizáveis em chama (hidrocarbonetos) FID: Detector resistente, robusto.

20. corrente elétrica Referência Gás de arraste filamento 5) Detectores: B) Detector de Condutividade Térmica (TCD) Princípio: A velocidade de perda de calor de um corpo quente depende dos gases presentes na região. -Apresenta resposta a todos os compostos, universal. -Detector simples, baixo custo e boa estabilidade.

21. 5) Detectores: C) Detector de Nitrogênio-Fósforo (NPD) O detector de nitrogênio-fósforo utiliza um sistema similar ao FID. Entretanto ele utiliza uma pequena pérola de rubídio (elemento ativo) que é eletricamente aquecido. Na presença dessa fonte termoiônica, compostos que contém nitrogênio ou fósforo na molécula são eficientemente ionizados. Os íons são coletados e a corrente elétrica é medida. -Dispendioso e de estabilidade regular, -Altamente seletivo -Excelente detector para compostos contendo nitrogênio ou fósforo na molécula.

22. 5) Detectores: C) Detector por Captura de Elétrons (ECD) O ECD tem seu funcionamento baseado na acaptura de elétrons pela substância a ser detectada, elétrons estes gerados pela ionização do gás de arraste por uma fonte radioativa. • elemento radioativo Ni63- emite partículas •  + N2 N2+ + e- (são detectados por um anodo) • X + e- X- + N2+ X + N2 -Insensível a presença de hidrocarbonetos, álcoois e cetonas. -Sensível para compostos clorados, bromados (halogênios), compostos organometálicos.

23. 6) Registradores (sistemas de dados) Impressora (integrador) -fácil de operar -preço moderado Computador (workstation) -mais caro -mais flexível, poderoso.

24. ANÁLISE QUALITATIVA A identificação de substâncias por cromatografia em fase gasosa se dá através do tempo de retenção (TR) da substância na coluna cromatográfica comparada com padrões. Injeção de amostra Injeção de padrão

25. ANÁLISE QUANTITATIVA A quantidade de analito (substância) é proporcional à área ou a altura do pico correspondente. 1 ng de substância 2 ng de substância

26. ANÁLISE QUANTITATIVA Para se calcular a concentração de uma substância em uma amostra é necessário se fazer uma curva de calibração. Duas formas: A) Método do padrão externo B) Método do padrão interno

27. ANÁLISE QUANTITATIVA A) Padrão externo Faz-se uma curva com várias concentrações do analito. A seguir injeta-se o extrato da amostra cuja concentração se quer determinar e lança-se no gráfico as áreas obtidas dos picos contra as concentrações dos adicionados.

28. ANÁLISE QUANTITATIVA B) Padrão Interno (PI) O padrão interno (PI) é um composto que se adiciona à amostra, antes de qualquer manipulação (extração) de forma que não interfira com a análise. O PI tem a função de corrigir possíveis imprecisões durante a manipulação da amostra (fase de extração, injeção da amostra) ou mesmo variações no equipamento de GC. O PI também tem a função de monitorar possíveis erros de operação ou procedimentos durante a análise. O PI deve ter preferencialmente as seguintes características: a) nunca ser encontrado na amostra; b) ser disponível em elevado grau de pureza; c) ser bem resolvido dos outros picos; d) ser estruturalmente semelhante ao analito, ou possuir os mesmos grupos químicos do analito.

29. ANÁLISE QUANTITATIVA B) Padrão Interno (PI) Exemplos: 1 Cocaína Isopropilbenzoilecgonina (PI) 2 Etanol Propanol (PI)

30. TR PI TR X X PI Obs: Para análise qualitativa, também é importante a presença do padrão interno, pois os tempos de retenção (TR) podem variar de uma injeção para outra, devido às variações no próprio equipamento. Desta forma, para identificação da substância, utiliza-se o tempo de retenção relativo (TRR) que é o tempo de retenção do analito dividido pelo tempo de retenção do padrão interno. Esse valor está menos sujeito à variações. TRRx = TRx / TRPI

31. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA HPLC- HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPH Fase móvel : solução, solventes (solução tamponada, metanol, acetonitrila) Fase estacionária: coluna cromatográfica - Substâncias que podem ser analisadas por HPLC: antibióticos, diuréticos, fármacos, drogas de abuso, proteínas, a.a., tensoativos, etc.. Ao contrário do GC podem ser analisadas substâncias não voláteis ou termicamente instáveis.

32. ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE HPLC 4 5 7 1 3 2 6

33. 1) Válvula de injeção de amostra -injeção manual (loop) -injeção automática (amostrador automático) 2) Bombas de pressão: 100 a 500atm - permite velocidade de fluxo razoável para o empacotamento de partículas de 3 a 10m. As vazões normalmente empregadas em HPLC vão de 0,005 até no máximo 4 a 5ml/min.

34. 3) Fase móvel: A fase móvel deve ser desgaseificada para remover gases dissolvidos que poderiam causar interferências. Utiliza-se ultra-som e bombas de vácuo. Também deve ser filtrada para evitar entupimento da coluna cromatográfica. Podem ser utilizados dois tipos de eluição: -isocrática: quando se mantém a composição da fase móvel constante durante toda a análise cromatográfica. -programação de gradiente: quando altera-se a composição da fase móvel durante a execução da análise. Utiliza-se dois ou mais solventes com polaridades diferentes

35. 4) Coluna cromatográfica: - Fase normal: Fase estacionária polar (ex. trietilenoglicol) Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro, Aumentando-se a polaridade da Fase móvel, o tempo de eluição diminui. -Fase reversa Fase estacionária não polar (Ex. hidrocarbonetos) Fase móvel relativamente polar (água, metanol, acetonitrila) O componente mais polar é eluído primeiro, Aumentando-se a polaridade da fase móvel, o tempo de eluição aumenta. Obs. A maioria das separações por HPLC são de fase reversa com empacotamentos ligados de C8 ou C18 siloxanos.

36. 5) Detectores: A) Detectores UV/Vis B) Detectores de fluorescência C) Detectores por índice de refração D) Detectores eletroquímicos

37. 5) Detectores: A) Detectores UV/Vis Os fotômetros UV foram os detectores mais empregados em HPLC. Eles medem as variações na absorbância na luz na região de 190 a 350nm durante a passagem do efluente da coluna na célula de fluxo. O mesmo projeto de detector, com poucas variáveis permite a leitura na região do visível (350 a 700nm), onde, porém, a sensibilidade é bem menor. Devido a algumas razões técnicas envolvendo as lâmpadas de UV empregadas, os primeiros detectores assumiam como comprimento de onda universal de 254nm. Atualmente existem os detectores de rede de diodos (diode array detector-DAD) que praticamente permitem levantar o espectro da substância durante a eluição.

38. 5) Detectores: B) Detectores de fluorescência Detectam substâncias que emitem fluorescência. C) Detectores por índice de refração Os detectores por índice de refração medem as mudanças do índice de refração do efluente das colunas. É um detector universal, não seletivo, não muito sensível e por isso empregado quando os outros não respondem ao composto de interesse. D) Detectores eletroquímicos Os detectores eletroquímicos se baseiam na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando estiverem na presença de um potencial elétrico.

39. CARACTERÍSTICAS DAS DUAS TÉCNICAS (GC E HPLC) -Eficiente, altamente seletivo, largamente aplicável, -Quando utilizado PI, análises bastante precisas, -Boa sensibilidade, -Necessitam de procedimentos de extração da amostra, -Necessitam de equipamentos específicos e profissionais treinados para operá-los. -Possibilidade de se detectar várias substâncias em uma mesma análise, -Há possibilidade de interferentes.

40. Referências CIOLA, R. Fundamentos de cromatografia a líquido de alto desempenho HPLC. São paulo: Ed. Edgard Blücher, 1998. LANÇAS, F. Cromatografia Em Fase Gasosa. Ed. São Carlos: ACTA, 1993. YONAMINE, M. Apresentação oral: aula expositiva. São Paulo, ago. 2004, abr. 2005.