Diagnosi

2. Il percorso diagnostico in allergologia Diagnosi Sintomo

3. Diagnosi Sintomo Il percorso diagnostico in allergologia

4. L’Iter diagnostico si fonda su: • Anamnesi; • Esame obiettivo; • Indagini allergologiche

5. Anamnesi • Una anamnesi corretta permette da sola : • di individuare circa il 60 % dei pazienti allergici ; • ha una specificità che sfiora il 95% ; • consente di individuare la presenza di comorbidità

6. Esame Obiettivo: • Non presenta caratteristiche peculiari, • Può essere negativo per la caratteristica accessionalità delle sindromi allergiche (utile esaminare il paziente in fase acuta e in fase intervallare, per confrontare i reperti osservati);

7. Indagini Allergologiche : Test in vivo Prick test Intradermoreazioni Patch test Test di provocazione Test in vitro Dosaggio IgE sieriche Dosaggio mediatori

8. Principi diagnostici delle malattie IgE-mediate Cute Test Cutanei Dosaggio delle IgE specifiche nel siero Sangue Rilascio istamina Attivazione basofili Challenge specifico nasale, bronchiale, congiuntivale, orale Conta Eosinofili Mucosa

9. Indagini allergologiche in vivo Prick test alimenti Prick test Patch test Test intradermico TPO

10. Prick test e allergia respiratoria • Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi • Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi • Prick & Storia Clinica Controversi

11. Prick test e allergia alimentare • Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi • Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi • Prick & Storia Clinica Controversi • TPO

12. TEST IN VITRO • Determinazione IgE totali e specifiche verso estratti e verso singole moleole • Determinazione di anticorpi non-IgE verso allergeni • Dosaggio di mediatori chimici flogogeni • Dosaggio di immunocomplessi • Dosaggio di frazioni complementari • Eosinofili su secreto nasale

13. Determinazione delle IgE • IgE Totali • IgESpecifiche • Le IgE totali costituiscono lo 0,004% di tutte le immunoglobuline.

14. Dosaggio delle IgEs IgESpecifiche verso estratti IgESpecifiche verso singolemolecole

15. TERMINOLOGIA • Fonte allergenica • Estratto allergenico • Allergene • Isoallergene • Epitopo

16. FONTE ALLERGENICA Indica il contenitore materiale degli allergeni, ad es. : la parietaria, l’uovo, sono fonti allergeniche, non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento.

17. ESTRATTI ALLERGENICI Gli estratti allergenici comunemente impiegati per la diagnostica in vivo (Ptick test) e in vitro (RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche (polline di graminacee,parietaria,uovo ecc.).

18. Caratteristiche degli Estatti Allergenici: • Gli Estratti Allergenici Grezzi contengono: • gli allergeni responsabili della sensibilizzazione, • altre sostanze e proteine • L’Estratto Antigenico viene sottoposto a processo di tipizzazione degli allergeni facendolo reagire con il siero di pazienti contenenti le IgE specifiche. • il Materiale Grezzo viene sottoposto a processo estrattivo della componente proteica, • Ciascun soggetto allergico possiede infatti un proprio caratteristico Assetto Allergenico per la presenza di IgE specifiche rivolte verso l’uno o l’altro componente allergenico dell’estratto. • La Componente Proteica viene trattata per individuare le sostanze con potere antigenico (mappa antigenica dell’ estratto),non tutte fornite di potere allergenico

19. ALLERGENI Gli allergeni sono proteine, glicoproteine o apteni coniugati a carrier, con peso molecolare tra 5 e 150 kDa, e punto isoelettrico compreso tra 2-10

20. ISOALLERGENI Indicano forme molecolari multiple dello stesso allergene proveniente dallo stesso organismo con un’estesa, ma non obbligatoria, cross-reattività. Hanno in genere un peso molecolare molto simile, la stessa struttura terziaria e la stessa funzione biologica e hanno almeno il 67% d’identità nella sequenza aminoacidica. Ad esempio di Bet v 1 si conoscono 31 isoallergeni con identità di sequenza tra il 73 e il 98%.

21. Isoallergeni Xxx y1.01 Xxx y1

22. EPITOPI Gli Epitopi sono la porzione di allergene effettivamente riconosciuta e legata da un anticorpo specifico Ciascun allergene può presentare un numero elevato di epitopi pertanto ad es. non esistono IgE specifiche per latte (fonte allergenica) o per caseina (allergene del latte) ma IgE specifiche dirette verso gli epitopi della caseina. Gli Epitopi possono essere lineari o conformazionali

23. EPITOPO Lineare Epitopi “lineari” (aminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla struttura primaria dell’allergene) solitamente termo- e gastro-resistenti

24. EPITOPO Conformazionale Epitopi “conformazionali” (aminoacidi non in sequenza, non contigui, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della catena proteica possono diventare contigui, la loro formazione dipende quindi dalla struttura tridimensionale dell’allergene) solitamente termo- e gastro- labili

25. Effetto della cottura e della digestione sulle proteine alimentari E G 1 G G E 1 Processing G 2 2 E G G E G G Sampson & Cooke. J Immunol 1997; 159:2026-2032.

26. CLASSIFICAZIONE DELLE MOLECOLE ALLERGENICHE • Le molecole allergeniche si possono ulteriormente classificare in: • “GENUINE”, vere marcatrici di una determinata fonte (es. Ole e 1 è la proteina marcatrice dell’allergia al polline dell’olivo e delle altre Oleaceae) • “PANALLERGENI”, proteine condivise da fonti allergeniche anche tassonomicamente tra loro non correlate, responsabili di apparenti polisensibilizzazioni ai test eseguiti con estratti

27. Dalla Fonte allergenica alle molecole Genuine Panallergeni

28. Dosaggio delle IgEs • IgESpecifichevsestratti • RAST

29. Dosaggio delle IgEs Si può eseguire, in casi di dubbi, dopo aver effettuato i prick test, per ottenere conferma diagnostica • Possono essere eseguite, al posto dei test cutanei, quando questi risultino poco affidabili per: • iporeattività cutanea legata a: - età (primi anni di vita, età avanzata) - farmaci (anti h-1, steroidi, ecc.) - precedenti reazioni cutanee intensamente positive • alterata reattività cutanea (ipo o iperreattività) legata a: - malattia allergica in fase acuta e grave -  affezioni cutanee estese -. dermografismo

30. Il Dosaggio delle IgE Specifiche va attentamente e criticamente valutato • Il livello di IgE specifiche non è sempre correlato con la gravità della sindrome clinica • Il dosaggio di IgE specifiche ha sensibilità e specificità inferiori rispetto ai test cutanei • la positività delle IgE specifiche può non rivestire significato eziologico nei confronti della malattia in atto (es. Cross-reattività con alimenti vegetali, che si riscontra spesso nei pollinosici, senza che vi sia alcuna manifestazione clinica dopo ingestione di quegli alimenti).

31. Ricerca delle IgEs IgESpecifiche verso singolemolecole CRD: Component Resolved Diagnosis

32. Diagnosi Allergologica in vivo tradizionale Con estratto di Pleum pratense Prick test con estratto di Phleum

33. Diagnosi Allergologica in vitro tradizionale Con estratto di Phleum pratense

34. Allergologia Molecolare

35. Phleum: proteine e allergeni Immunoblotting di 12 paz. allergici al Phleum pratense Pattern delle proteine e immunoblotting del siero di pazienti allergici Estazione

36. Diagnosi Allergologica in vivo tradizionale Con estratto di Phleum pratense Prick test con estratto di Phleum Phl p1 + - Phl p12 + - Phl p 7 + - Phl p5 + -

37. Phleum pratense: proteine e allergeni La fonte allergenica…

38. …contiene milioni di molecole…. …di cui solo alcune hanno proprietà allergeniche

39. Che cosa è un allergene ricombinante? Un allergenericombinante è molecola allergenica prodotta con tecniche di biotecnologia originariamente identificata da un estratto allergenico. La maggior parte dei ricombinanti allergenici esistenti vengono espressi in Escherichia coli e sono normalmente confrontabili con il loro modellonaturale(proteina) per quanto riguarda le caratteristiche strutturali e le proprietà immunologiche. Caratteristiche Gli allergeni ricombinanti vengono prodotti senza che le proteine subiscano variazioni genetiche, biologiche o di lotto. Questo assicura l’ottenimento di allergeni di qualitàcostante ed elevata standardizzazione

40. IUIS – Nomenclatura WHO Phl p 1 .01 Genere Specie Cronologia • Isoallergeni • IDENTICHE FUNZIONI BIOLOGICHE • PESO MOLECOLARE SIMILE • >67% IDENTITA’ DELLA SEQUENZA AA.

41. Molecole Allergeniche: principali applicazioni 1. Miglioramento nel profilo diagnostico 2. Maggiori informazioni sulle poli-sensibilizzazioni (distinzione tra co-sensibilizzazione e co-riconoscimento) 3. Valutazione della potenziale gravità di una reazione clinica (alcune molecole allergeniche possono essere ”più pericolose” di altre) 4. Ruolo decisionale nell’ambito della ITS 5. Monitoraggio della risposta immunologica durante il trattamento … Lidholm J et al. Component-resolved diagnostics in food allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6:234-40

42. Polisensibilizzazione Cosensibilizzazione o Cross Reattività

43. Polisensibilizzazione CO-SENSIBILIZZAZIONE: presenza di IgE dirette versoepitopi distinti e unicipresenti in fonti allergeniche diverse (molecole allergeniche genuine) CO-RICONOSCIMENTO (cross-reattività): presenza di IgE versomolecole omologhepresenti in fonti allergeniche diverse (panallergeni) Asero R, 2010, mod.

44. Polisensibilizzazione • I “panallergeni” inalanti sono : • Profiline • CBP (Calcium binding protein o Polcalcine) Asero R, 2010, mod.

45. CBP Pollini, alberi, erbe, graminacee Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Phl p12 Phl p7 PROFILINA Genuine

46. La Diagnostica Molecolare nell’Allergia respiratoria

47. Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Genuine

48. Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Phl p12 PROFILINA Genuine

49. CBP Pollini, alberi, erbe, Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Phl p12 Phl p7 PROFILINA Genuine

50. CBP Pollini, alberi, erbe, Allergia Molecolare - Parietaria Parietaria 83 % Par j 3 Par j 2 PROFILINA Genuine Par j 4