Ravinteet ja kasvun seuranta

1. Mikrobiologia TF00AA22-2003 Ravinteet ja kasvun seuranta H. Ojamo & C. Fortelius

2. Solujen kemiallinen koostumus • Tyypillisen prokaryoottisolun kuiva-aineen koostumus Makromolekyylit yhteensä 96% molekyyliä/solu • proteiinit 55% 2.3x106 • polysakkaridit 5% 4300 • lipidit 9% 22x106 • lipopolysakkaridit 3.5% 1.4x106 • DNA 3% 2.1 • RNA 20.5% 255500 • Monomeerit yhteensä 3% • aminohapot ja prekursorit 0.5% • sokerit ja prekursorit 2% • nukleotidit ja prekursorit 0.5% • Epäorgaaniset ionit 1% • Soluissa noin 70% vettä ja 30% kuiva-ainetta • Solujen makromolekyylien pitoisuudet vaihtelevat olosuhteiden mukaan (erityisesti RNA-pitoisuus kasvunopeuden mukaan)

3. Solujen kemiallinen koostumus • Prokaryoottisolun alkuainekoostumus karkeasti: • C 50 % • O 20 % • N 14 % • H 8 % • P 3 % • S 1 % • K 1 % • Na 1 % • Ca 0,5 % • Mg 0,5 % • Cl 0,5 % • Fe 0,2 % • muut 0,3 % • Soluille voidaan antaa kemiallinen kaava koostumuksen mukaan esim. hiiva (S. cerevisiae) C H1,75 N0,15 O0,5 MW = 23,9 g/mol bakteeri C H1,67 N0,2 O0,27 MW = 20,7 g/mol esim. => 1 C-mol hiivaa = 23,9 g

4. * Metabolism * • Microbial metabolism is the way in which microbes obtain the energy and nutrients required to survive. • Metabolism is the sum of all chemical reactions within a living organism including anabolic (biosynthetic) and catabolic (degradative) reactions. • Catabolism is the breakdown of complex molecules into organic molecules and yields energy. • This energy is stored in the bonds of adenosine triphosphate or ATP. • Enzymes play an integral role in metabolism as they are responsible for lowering the activation energy of reactions or speeding up the rate at which they take place.

5. Solujen kemiallinen koostumus • Koostumuksen merkitys • solujen täytyy jostain saada oikeissa suhteissa ja oikeissa muodoissa kaikki alkuaineensa • solujen aineenvaihdunnasta (erityisesti anaboliasta) riippuu, missä muodossa nämä aineet on soluille tarjottava • näitä aineita nimitetään ravinteiksi (C-, energia-, N-, P- jne.)

6. Solujen kemiallinen koostumus • solut pystyvät syntetisoimaan suuren osan tarvitsemistaan kemiallisista yhdisteistä • monia yhdisteitä solut silti tarvitsevat valmiina tai niiden synteesi solussa vaatii prekursoreiden saamista solun ulkopuolelta • jotkut mikrobit tulevat toimeen hyvin vähillä ravinteilla (ääriesim. syanobakteerit), toiset ovat hyvin vaativia (engl. fastidious) ravinteidensa suhteen (esim. yleensä maitohappobakteerit)

7. Ravinteet mikrobien kasvatuksessa / viljelyssä • Mikrobeja kasvatetaan ravintoliuoksilla (esim. fermentointiprosessin kasvatusalusta) ja viljellään kiinteillä alustoilla (esim. agareilla Petri-maljoilla) • Periaatteessa ravintoliuoksen ja kiinteän alustan alkuainekoostumus voidaan laskea, kun tunnetaan mikrobisolujen koostumus (esim. hiivalle 100 mg N/tuo tettu g hiivaa; 20 mg P/tuotettu g hiivaa jne.)

8. Ravinteet mikrobien kasvatuksessa / viljelyssä • Yksinkertaisimmissa tapauksissa (esim. leivinhiiva tai monet homeet) todella riittää, kun lasketaan N/C- ja P/C-suhteet ja C-/energia-lähde lisätään kompleksisena ravinteena (esim. melassi tai lese) ja N ammoniumsuolana ja P fos faattina tai fosforihappona; tarvittavat vitamiinit ja hivenaineet (esim. epäorgaa niset ionit) tulevat riittävässä määrin kompleksisesta ravinteesta ja vedestä (ei tislattua vettä) • Erityisesti agareilla viljeltäessä (kun alustan hinta ei ole tärkeä) käytetään useampia kompleksisia ravinteita (esim. hiivauute, tryptoni, peptoni, mallasuute, veri jne.)

9. Ravinteet mikrobien kasvatuksessa / viljelyssä • Kasvatettaessa mikrobeja fermentointiprosesseissa kasvatusalustan hinta on usein tärkeä kustannustekijä => selvitettävä ko. mikrobin ravinteiden tarve ja ”optimoitava” alusta • Useat mikrobit vaativat monia vitamiineja ja hivenaineita, monet myös tiettyjä aminohappoja; tarkkaan määritellyissä alustoissa (defined media) nämä lisätään yksittäisinä kemikaaleina – kompleksisissa alustoissa lisätään luonnon sekoituksia näistä komponenteista • Tyypillinen entsyymin tuottoalusta homeelle: • Hera 60 g/l (ka.) • (NH4 )2SO 4 5 g/l • (NH4 )2HPO 4 5 g/l • MgSO4 1 g/l

10. Ravinteet mikrobien kasvatuksessa / viljelyssä • Useille mikrobeille on olemassa perinteisiä omia kasvatusalustoja; näiden koostumuksia löytyy käsikirjoista sekä mikrobikantakokoelmien luetteloiden liitteinä; esim. VTT:n kantakokoelma: • http://www.vtt.fi/bel/palvelut/mikrobikokoelma • http://www.inf.vtt.fi/pdf/tiedotteet/1999/T1980.pdf • Useita kasvatusalustoja myydään valmiina seoksina; erityisesti erilaisia agareita (esim. ravintoagar (nutrient agar); vierreagar (wort agar); PDA (peruna dekstroosi agar) • Kun ravintoalusta halutaan kiinteyttää maljaviljelyä varten lisätään normaaliin koostumukseen 15 g/l agaria

11. Kiinteä vs nestemäinen alusta • Luria broth: tryptoni 10 g/l – hiivauute 5 g/l – NaCl 10 g/l • Luria agar: em. + 15 g/l agar • MYGP: mallasuute 3 g/l – hiiva uute 3 g/l – glukoosi 10 g/l – peptoni 5 g/l • MYGP agar: em. + 15 g/l agar

12. Ravinteet mikrobien kasvatuksessa / viljelyssä • Tavallisimmat viljelyalustat laboratoriossa: • ravintoagar/broth bakteerit yleensä • Luria bakteerit yleensä • MRS maitohappobakteerit • GYM Streptomyces • Vierre panimohiivat • Vierre+sakkaroosi leivinhiivat • YM muut hiivat (esim. Candida, Kluyveromyces…) • YPD hiivat • Tavallisimmat lyhenteet: • Y tai YE hiivauute • M mallasuute • G tai D glukoosi (= dekstroosi) • P peptoni • T tryptoni

13. Ravinteiden merkitys soluissa • C (hiili) • solujen pääalkuaine (n. 50%), aminohapoissa, proteiineissa, hiilihydraateissa, rasvahapoissa, lipideissä, vitamiineissa • N (typpi) • toiseksi runsain solujen alkuaine (n. 12 %); aminohapoissa, proteiineissa, nukleotideissa, nukleiinihapoissa • P (fosfori) • nukleiinihapoissa, fosfolipideissä (solujen kalvoissa eli membraaneissa) • S (rikki) • kysteiini- ja metioniini- aminohapoissa, monissa vitamiineissa (tiamiini, biotiini), koentsyymi A:ssa (CoA) • K (kalium) • jotkut entsyymit vaativat kaliumia • Ca (kalsium) • stabiloi solujen seinämää ja suojaa itiöitä ja joitakin entsyymejä lämpö inaktivaatiolta • Fe (rauta) • olennainen soluhengityksessä (elektronien siirto) • Mikroravinteet • jotkut entsyymit vaativat tiettyä metallia koentsyyminä; B12-vitamiinissa Co (koboltti) välttämätön

14. Ravinteiden merkitys soluissa • Kasvutekijät • kuten mikroravinteita, tarvitaan hyvin pieniä pitoisuuksia • vitamiinit • aminohapot • puriinit (nukleiinihappojen emäksiä; G ja A) • pyrimidiinit (nukleiinihappojen emäksiä C, T, U) • näiden vaatimukset vaihtelevat kovasti mikrobisuvun/lajin/kannan mukaan

15. Mikrobien kasvu • Kasvu = solun kaikkien kemiallisten komponenttien järjestäytynyt lisääntyminen • Solumassan tuotto, solujen lukumäärän lisääntyminen (solut voivat myös tuottaa esim. jotain polysakkaridia ilman solujen kasvua; tällöin solumassa lisääntyy ilman kasvua) • Solut voivat kasvaa ilman, että elävien solujen lukumäärä lisääntyy, kun kasvun ohella tapahtuu solujen kuolemista

16. Mikrobien kasvu • Nn = 2n No (solujen jakaantuminen tai kuroutuminen) • Kasvuvaiheet: lag-vaihe – eksponentiaalivaihe – stationäärivaihe – kuoleminen • Eksponentiaalivaiheessa solujen jakaantumistiheys on vakio = generaatioaika tg (h) tai tuplaantumisaika td (h) • Nt = 2kt No k = eksponentiaalinen kasvunopeusvakio (jakaantumisten lukumäärä/aikayksikkö)

17. Mikrobin kasvun vaiheet

18. Mikrobien kasvukinetiikka • dN/dt = mN m = spesifinen kasvunopeus (h-1); myös muodossa • dX/dt = μX X = solumassan määrä (g) tai pitoisuus (g/l) • μ:n riippuvuus kasvua rajoittavansubstraatin pitoisuudesta • μ = μmaxS/(S+KS) (Monod:n yhtälö tai Monod:n kinetiikka) • μ ja μmax –arvot riippuvat olosuhteista (T, pH, aw, [ravinteet] jne.) • esimerkkejä μmax-arvoista μmax (h-1) • Pseudomonas natriegens 4.3 • E. coli 2.0 • B. subtilis 1.6 • S. cerevisiae 0.5 • M. tuberculosis 0.1

19. Kasvun seuranta Elävien solujen lukumäärän (viable count) määrittäminen (edellytys kasvu maljalla pesäkkeinä): • aseptinen työskentely • homogeeninen näyte • näytteestä laimennossarja (esim. 10-1…10-9) • useamman laimennoksen viljely sopivalla agarilla maljoilla (maljalevitys) • maljojen inkubointi • pesäkkeiden laskenta sopivilla laimennoksilla (10…220 pesäkettä/malja)

20. Kasvun seuranta Tulosten laskeminen painotetun keskiarvon avulla = = ∑ c , jossa c on laskettujen pesäkkeiden summa ∑ v ja v on alkuperäisen näytteen summatilavuus Tulos ilmoitetaan esim. 500 +/- 5* pmy/ml tai 5 x 102 pmy/ml (*mikäli rinnakkaisnäytteiden avulla voidaan arvioida hajontaa) HUOM! Tarkistakaa aina alkuperäisen näytteen muoto (neste, kaasu tai kiinteä) ja ilmoittakaa lopputulos tilavuus- tai painoyksikköä kohden)

21. Kasvun seuranta • Solujen lukumäärän laskeminen (lähinnä yksisoluisilla riittävän isoilla, ei aktiivisesti liikkuvilla soluilla, kuten hiivat): • aseptinen työskentely • homogeeninen näyte • näytteen laimennos • natiivipreparaatti mikroskopointiin laskukammiolle (esim. 1 ruutu: 0.2x0.2x0.1 mm3) • useiden ruutujen laskeminen eri näkökentissä • tuloksen laskeminen (esim. 5x108 solua/ml)

22. Kasvun seuranta • Sameuden mittaus (edellytys kirkas ravintoliuos ja mikroskooppinen kasvu sekä riittävä solupitoisuus > 107 /ml): • ei tarvita aseptista työskentelyä • homogeeninen näyte • laimennos • sameuden mittaus aallonpituudella 600…700 nm spektrofotometrilla tai • (vanhanaikaisella) KLETT-mittarilla • tuloksen laskenta (esim. OD660 = 25) • sameusarvon muuttaminen solumassan pitoisuudeksi (ko. mikrobin standardi”suora”)

23. Kasvun seuranta • Kiintoainepitoisuuden määritys (edellytys kirkas kiintoaineeton ravintoliuos): • ei tarvita aseptista työskentelyä • homogeeninen näyte • solujen erotus (sentrifugointi tai suodatus) mitatusta määrästä näytettä • solujen pesu (vedellä tai fysiologisella suolaliuoksella, jos aihetta pelätä solujen lyysiä vedellä pestäessä) • pestyn solumassan kuivaaminen (yleensä 80…105 C, 4…18 h) • punnitus ja laskenta (suolapitoisuuden arviointi) (esim. 5 g/l)

24. Kasvun seuranta • Jonkin aineenvaihduntatuotteen muodostumisen seuraaminen • usein kvalitatiivinen tai puolikvantitatiivinen • voi olla myös kvantitatiivinen, kun tarkkaan tiedetään ko. tuotteen muodostumisen kvantitatiivinen riippuvuus kasvusta tai solumäärästä (kasvun matemaattiset mallit) • käyttökelpoisia • pH (kvalitatiivinen) • poistokaasun CO2-pitoisuus tai sen tuottonopeus • hapen kulutusnopeus (aerobeilla) • liuenneen hapen pitoisuus (kvalitatiivinen)

25. Kasvun seuranta • Mittausten virhelähteitä: • elävien solujen lukumäärä maljaviljelyllä • näytteenotto, laimennosten teko, solujen kasautuminen (ketjuiksi tai flokeiksi) laimennosvaiheissa tai levityksessä maljalle, pienten pesäkkeiden laskematta jättäminen, kaasukuplat agarissa • laskukammio • näytteenotto, fokusointivaikeudet ja solujen sijainti eri tasoilla mikroskopoinnissa, solujen liike, pienet solut • sameus • näytteenotto, mittaus epälineaariselta alueelta, kaasukuplat, solujen laskeutuminen

26. Kasvatus-/viljelytapoja • Agar: petrimaljat, vinopinnat ja pistoviljelmät • Isomman nestenäytteen suodattaminen ja suodattimen viljely agarmaljalla • agarilla viljeltäessä voidaan olosuhteista säätää lähinnä T ja kaasuatmosfääriä • Pullokasvatukset: ravistelu- tai staattiset pullot, pulloissa voi olla myös sekoitusta ja ilmastusta tehostavia sekoitushaittoja, KLETT-pullot • pulloissa voidaan säätää T (termostoitu kasvatushuone tai vesihaude), osittain pH (puskuroimalla kasvatusalusta etukäteen), sekoitusta (ravistelunopeus ja tapa), liuoksen ”ilmastusta” (sekoitus, haitat, nestetilavuus/pullon kokonaistilavuus)

27. Kasvatus-/viljelytapoja • Bioreaktorikasvatukset (fermenttorit): mekaanisesti tai ilmalla sekoitetut säiliöt • reaktorit hyvin instrumentoituja ja säädöt T, pH, DO (dissolved oxygen = liuenneen hapen pitoisuus), p, redox-potentiaali, ravinteiden syöttö, fermentointiliuoksen poisto, jne. • Kasvatukset pinnoilla pylväissä tai sekoitusreaktoreissa: immobilisoidut solut tai biofilmit joko sekoitusreaktoreissa tai kiinteissä tai leijuvissa pedeissä